Process Impurity Assay
유전자 치료제의 설계 합리성, 공정 개발, 품질 관리는 최종 제품의 임상적 안전성과 유효성에 직접적인 영향을 미칩니다. 이는 바이러스성 및 비바이러스성 벡터 기반의 시험관 내 유전자 변형 시스템 모두에 해당됩니다.
안전성 평가의 중요성
유전자 전달 벡터의 설계, 처리(processing), 그리고 방출(release)에 대해 생물 안전성 연구 및 위험성 평가가 조사되어야 합니다. 이는 환자에게 투여될 최종 제품의 잠재적 위험을 최소화하기 위함입니다.
SHENTEK®의 품질 관리 시험 항목
SHENTEK®은 유전자 전달 벡터의 생물 안전성 평가를 위해 다음과 같은 핵심적인 품질 관리 시험을 제공합니다.
유전자 복제 수 확인 (Identification of gene copy number)
벡터가 세포에 얼마나 잘 전달되었는지, 그리고 원하는 유전자가 목표 세포 내에 얼마나 많은 수로 존재하는지를 정량적으로 파악합니다. 이는 제품의 효능 예측에 중요합니다.
복제 능력 바이러스 검출 (Detection of replication competent viruses, RCVs)
특히 바이러스성 벡터(예: AAV, Ad)를 사용할 경우, 제조 과정 중 발생할 수 있는 복제 능력 바이러스의 존재 여부를 검출합니다. RCV는 환자 체내에서 통제 불가능하게 증식하여 심각한 염증 및 병원성을 유발할 수 있으므로, 최종 제품에서 반드시 부재함을 입증해야 하는 결정적인 안전성 지표입니다.
유전적 안정성 검사 (Examination of genetic stability)
벡터가 목표 세포에 전달된 후, 삽입된 치료 유전자(transgene)가 안정적으로 유지되고 발현되는지 확인합니다. 이는 장기간의 치료 효과를 보장하기 위해 중요합니다. 이러한 시험들은 유전자 치료제가 규제 기관의 요구 사항을 충족하고 임상적으로 안전하며 효과적임을 보장하는 데 필수적입니다.
외래 유전자(exogenous gene) 삽입 위치와 삽입 위치의 상대적 복제 수가 표적 세포의 유전자 발현 수준을 결정하기 때문에, 유전자 구조물(gene construct)을 세포에 도입한 후 형질 도입/형질 감염 효율을 제어하기 위한 수단으로 최종 제품에 삽입된 유전자의 복제 수를 측정해야 합니다. 유전적으로 변형된 표적 세포 내의 유전자 도입 유전자(transgene) 복제 수를 분석하기 위해 고감도 및 고처리량(throughput)의 실시간 PCR(real-time PCR)이 사용되어 왔으며, 디지털 PCR(digital PCR) 방법 또한 절대 복제 수를 결정하는 데 사용됩니다.
렌티바이러스 벡터는 CAR 또는 TCR 유전자 서열을 세포 치료제에 도입하는 데 사용됩니다. 그러나 개개인 게놈(genome)의 변이로 인해 말초 T 세포로 전달된 렌티바이러스 특이적 TCR 유전자의 복제 수가 가변적일 수 있으며, 이는 이질적인 CAR-T 세포 집단 내에서 서로 다른 세포 독성(cytotoxicity)을 초래합니다.
SHENTEK® CAR/TCR 유전자 복제 수 정량 키트는 rHIV-1 렌티바이러스 벡터로 형질 감염된 CAR-T 세포에서 유전자 도입 유전자 복제 수를 검출하기 위한 신뢰할 수 있고 정확한 품질 관리 테스트입니다.
이 키트는 멀티플렉스(multiplex) 실시간 PCR 분석법을 사용하여, 인간 세포 집단 내에서 유전자 도입 유전자 발현을 위한 게놈 DNA의 수와 단일 복제 유전자(single-copy gene)의 수를 비교함으로써 평균적인 관심 유전자(gene-of-interest) 복제 수를 검출하고 상대적으로 정량화하도록 개발되었습니다. 정량 참조 표준 물질(Quantitation reference standards)이 키트에 포함되어 있습니다.
복제 능력 바이러스(Replication-competent virus, RCV)의 위험은 바이러스 벡터 사용에 있어 중요한 생물 안전성 문제입니다. 숙주 서열과의 재조합(recombination)이나 오염을 통해 복제 능력을 가진 바이러스가 생성될 수 있으며, 그 가능성은 낮지만 반복적인 복제가 거듭될수록 증가할 수 있습니다. 따라서 면역원성 위험(immunogenicity risks)을 포함한 잠재적 위험을 피하기 위해, 벡터 생산 공정의 여러 단계에서 대규모 벡터 집단 내 복제 능력 바이러스 검출을 위한 민감하고 정확한 분석법이 품질 관리를 위해 요구됩니다.
SHENTEK®은 다양한 복제 결함(replication-defective) 바이러스 벡터의 품질 관리를 위한 복제 능력 바이러스 qPCR 분석 키트를 제공합니다. 이 테스트들은 마스터 세포 은행(master cell banks), 작업 세포 은행(working cell banks), 생산 종료 세포(end of production cells), 벌크 수확물(bulk harvest), 상층액(supernatant), 그리고 형질 도입 후 세포 제품(post-transduction cell products)에 사용하도록 설계되었습니다.
SHENTEK® 복제 능력 렌티바이러스(RCL) 정량 키트
SHENTEK® RCL 정량 키트는 렌티바이러스 벡터 제조물 및 세포·유전자 치료제 형질 도입 후 제품에서 복제 능력 렌티바이러스(RCL)를 빠르고 민감하게 검출하는 데 적합합니다. 예를 들어, 마스터 또는 작업 세포 은행, 생산 종료 세포, 바이러스 벡터 수확물 또는 상층액, 그리고 CAR-T 세포와 같은 제품에 사용될 수 있습니다. 이 분석법은 실시간 RT-PCR을 사용하여 동일한 반응 조건 하에서 표준 물질과 샘플 모두에서 특정 서열의 PC 증폭을 평가함으로써 RCL의 복제 수를 정확하게 정량합니다. RCL 정량 표준 물질이 키트에 포함되어 있습니다. 이 분석법은 특이성이 매우 높으며 약전 규정(pharmacopeia regulations)의 요구 사항을 준수하여 완벽하게 검증되었습니다. 또한, ISO13485 품질 표준 및 규제 요구 사항을 준수하여 개발 및 제조되었습니다.
SHENTEK® 복제 능력 레트로바이러스(RCR) 정량 키트
SHENTEK® RCR 정량 키트는 레트로바이러스 벡터 제조물과 세포 및 유전자 치료제 형질 도입 후 제품에서 복제 능력 레트로바이러스(RCR)를 빠르고 민감하게 검출하는 데 적합합니다. 예를 들어, 마스터 또는 작업 세포 은행, 생산 종료 세포, 바이러스 벡터 수확물 및 상층액, 그리고 CAR-T 세포와 같은 제품에 사용될 수 있습니다. 이 분석법은 실시간 RT-PCR 기술을 기반으로 하며, 동일한 반응 조건 하에서 샘플과 표준 물질에 있는 특정 서열의 증폭을 평가하여 RCR의 복제 수를 정확하게 정량합니다. RCR 정량 표준 물질이 키트에 포함되어 있습니다. 이 분석법은 특이성이 매우 높으며 약전 요구 사항(pharmacopeia requirements)을 준수하여 완벽하게 검증되었습니다. 또한, ISO13485 품질 표준 및 규제 요구 사항을 준수하여 개발 및 제조되었습니다.
SHENTEK® 복제 능력 아데노 부속 바이러스(rcAAV) 정량 키트
SHENTEK® rcAAV 정량 키트는 재조합 AAV(rAAV) 벡터 제조물뿐만 아니라 AAV 기반 유전자 치료 제품에서 복제 능력 AAV(rcAAV)를 빠르고 민감하게 검출하는 데 적합합니다. 이 혈청형 특이적 qPCR 분석법은 세포 기반 증폭 과정 후에 수행되어 진정한 복제 능력을 가진 AAV와 복제 결함 AAV를 구분할 수 있습니다. 또한, 바이러스 벡터 제품 내에 잠재적으로 존재하는 낮은 수준의 rcAAV를 직접 검출하는 데에도 적용될 수 있습니다.qPCR 분석을 위해 설계된 참조 서열(reference sequence)과 표적 서열(target sequence)은 동일한 표준으로 준비되어, rAAV 벡터와 rcAAV를 동시에 빠르고, 민감하며, 혈청형 특이적으로 정량할 수 있도록 합니다. rcAAV 검출을 위해 선택된 표적 DNA 서열은 AAV 복제에 필수적인 특징인 AAV ITR-rep 유전자 연결 부위(junction)에 걸쳐 있어, rcAAV의 잠재적 오염 수준을 최대로 검출할 수 있도록 합니다. SHENTEK®은 rAAV 벌크(bulk)부터 최종 제품 및 형질 도입 후 세포 샘플에 이르는 광범위한 샘플에서 rcAAV 혈청형 2/N 및 5/N (N은 모든 캡시드 단백질을 나타냄)을 검출하기 위한 두 가지 혈청형 특이적 qPCR 분석법을 제공합니다.
SHENTEK® 바이러스 DNA 및 RNA 추출 키트는 10⁷ cells/mL 이하의 세포 배양액과 바이러스 수확물 또는 상층액을 포함한 다양한 샘플 매트릭스에서 고품질의 바이러스 핵산(nucleic acid)을 추출하도록 설계되었습니다. 이 추출 효율은 앞서 언급된 샘플에 가짜 바이러스(pseudoviruses), 외피 RNA 바이러스(armor RNA viruses), 세포 배양 배지에 있는 소 바이러스(bovine viruses), 그리고 바이러스 벡터 샘플 내의 복제 능력 바이러스 등 다양한 농도의 바이러스를 첨가하여 신뢰할 수 있는 다운스트림(downstream) 성능을 위해 검증되었습니다. 이 키트는 자동 추출을 위한 rHCDpurify® 전처리 시스템과 호환됩니다. 추출된 바이러스 DNA/RNA는 PCR, RT-PCR, qPCR 및 qRT-PCR 실험과 같은 다운스트림 애플리케이션에 직접 사용될 수 있습니다.
핵산 추출 전에, 세포 용해물(cell lysate)의 샘플 전처리 방법은 바이러스 복제 경로에 따라 약간씩 다릅니다.
복제 능력 바이러스 (RCL/RCR) 및 대부분의 DNA 바이러스 (예: rcAAV) 또는 알려지지 않은 외부 바이러스 (adventitious viruses)와 같이, 바이러스가 핵에 국한되어 복제를 위해 숙주 세포의 DNA와 통합되는 경우, 세포 용해 후 벤조나제 뉴클레아제(benzonase nuclease)로 샘플을 처리하여 방출된 숙주 세포 게놈을 분해할 수 있습니다.
대부분의 RNA 바이러스와 같이 세포질에서 숙주 전사 및 번역을 이용하는 바이러스의 경우, 세포 용해 후 샘플을 원심분리하고 상층액이 핵산 추출에 직접 사용됩니다.
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