Shownin NK 세포 · 면역세포 배양

• Basal Medium: 2–8 °C
• Supplement: -80 °C ~ -20 °C
• Expansion Factor A·B의 보관 온도는 공식 표에 따로 적혀 있지 않습니다. 제품 라벨과 COA를 확인하세요.

함께 준비할 것

• IL-2 200 IU/mL — NK 완전 배지 조제 시 별도 첨가 (설명서)
• 자가 혈장(autologous plasma) 또는 사람 혈소판 용해물(hPL) — Day 0–7은 5%(v/v), Day 8–15는 1%(v/v)로 배지에 첨가 (설명서)
• 밀도 구배 분리액 (설명서 예: Ficoll-Paque PLUS) — PBMC 분리용 (설명서)
• NK-MAX Purification Factor — 선택. 확장 후 NK 순도를 높이기 위한 혈액 전처리 (설명서 권장 품목)
• Lymphocyte Cryopreservation Medium — 선택. PBMC 동결 보관용 (설명서 권장 품목)
• T25 또는 T75 플라스크, T175/T225 플라스크, 배양 백 — 배양 규모에 따라 (설명서 표 4)

자가 혈장 분리 (선택)

1. 신선한 혈액을 900 × g에서 20분 원심분리합니다(가속·감속은 가장 느리게).
2. 위층의 노란 혈장을 50 mL 튜브로 옮깁니다. 남은 혈구층은 단핵세포 분리에 씁니다.
3. 혈장을 56 °C 수조에서 30분 두어 불활성화한 뒤 1200 × g에서 10분 원심분리해 침전물을 없앱니다.
4. 불활성화한 혈장을 새 50 mL 튜브에 옮겨 4 °C에 보관합니다.

NK-MAX Purification Factor 전처리 (선택, 확장 후 NK 순도 향상)

1. 혈액 1 mL당 NK-MAX Purification Factor 12.5 µL를 넣은 새 튜브에 혈액을 담고 부드럽게 섞습니다.
2. 실온에서 20분 반응시킨 뒤 Ficoll-Paque PLUS로 PBMC를 분리합니다.

PBMC 준비

1. Ficoll-Paque PLUS를 이용한 밀도 구배 원심분리로 사람 전혈에서 PBMC를 분리합니다.
2. 분리한 PBMC는 바로 NK 확장에 쓰거나 Lymphocyte Cryopreservation Medium(SN-06-1410)으로 동결 보관할 수 있습니다.

NK 완전 배지(NK Complete Medium) 만들기

1. ncKnight™ NK Medium Basal Medium 1000 mL에 ncKnight™ NK Medium Supplement 40 mL와 IL-2(최종 200 IU/mL)를 섞습니다.

PBMC에서 NK 세포 확장

1. Day 0 (2 L 배양): PBMC를 5%(v/v) 자가 혈장 또는 hPL을 더한 NK 완전 배지에 1 × 10⁶ cells/mL로 총 10 mL(PBMC 1 × 10⁷개) 현탁해 T75 플라스크에 넣고, Expansion Factor A 270 µL와 B 120 µL를 더합니다. 37 °C, 5% CO₂에서 3일 배양합니다.
2. Day 0 (1 L 배양): 같은 방법으로 총 5 mL(PBMC 5 × 10⁶개)를 T25 플라스크에 넣고, Factor A 135 µL와 B 60 µL를 더해 3일 배양합니다.
3. Day 3–7: 5%(v/v) 자가 혈장 또는 hPL을 더한 NK 완전 배지를 추가해, 추가 후 세포 밀도가 1.0 × 10⁶ cells/mL가 되게 합니다.
4. Day 8–15: 1%(v/v) 자가 혈장 또는 hPL을 더한 NK 완전 배지를 추가해, 추가 후 세포 밀도가 1.0 × 10⁶ cells/mL가 되게 합니다. 배지 추가량은 아래 표를 참고합니다.
5. 수확: 14–16일 배양 후 세포 밀도가 2–3 × 10⁶ cells/mL에 이르면 200 × g에서 10분 원심분리해 NK 세포를 거둡니다.
6. 자세한 절차는 제품 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• Basal Medium: 2–8 °C
• Supplement: -80 °C ~ -20 °C

함께 준비할 것

• ncKnight™ NK Expansion Factor Kit — 확장 인자 A·B가 들어 있는 기본 키트 (공식 제품 페이지)
• IL-2 200 IU/mL — NK 완전 배지 조제 시 별도 첨가 (키트 설명서)
• 자가 혈장 또는 사람 혈소판 용해물(hPL) — 배양 단계에 따라 5% 또는 1%(v/v) 첨가 (키트 설명서)

NK 완전 배지(NK Complete Medium) 만들기

1. ncKnight™ NK Medium Basal Medium 1000 mL에 ncKnight™ NK Medium Supplement 40 mL와 IL-2(최종 200 IU/mL)를 섞습니다.
2. 배양 단계에 따라 5% 또는 1%(v/v) 자가 혈장 또는 hPL을 더해 씁니다.
3. 배양 절차는 ncKnight™ NK Expansion Factor Kit 설명서를 확인하세요.

• Supplement-01: -80 °C 또는 -20 °C
• Supplement-02: -80 °C
• Basal Medium: 2–8 °C

함께 준비할 것

• NK Expansion Kit (RP03030)의 NK Expansion Reagent A·B — Day 0 1차 활성화(A), Day 7 2차 활성화(B, 선택)에 사용 (설명서). 공식 페이지는 'Shownin NK Expansion Kit (Cat. No. RP03030)'와 함께 쓴다고 표기
• IL-2 200 IU/mL — NK 확장 배지 조제 시 별도 첨가 (설명서 권장: 주사용 재조합 사람 IL-2)
• 밀도 구배 분리액 (Ficoll) — 신선 혈액에서 PBMC 분리 (설명서)
• T75·T175 플라스크, 림프구 배양 백 (0.2–1.8 L) — 배양 규모에 따라 (설명서 표 2·3)
• NK-MAX Purification Factor — 선택. NK 순도를 더 높일 때 (공식 제품 페이지)

PBMC 준비 (신선 말초혈액)

1. 자가 혈장 분리: 신선한 혈액을 900 × g에서 20분 원심분리(가속·감속 가장 느리게)한 뒤 위층 혈장을 50 mL 튜브로 옮겨 56 °C에서 30분 불활성화하고, 1200 × g에서 10분 원심분리해 침전물을 없앤 다음 4 °C에 보관합니다.
2. PBMC 분리: 남은 혈구층을 생리식염수와 1:1로 희석해 Ficoll 위에 조심스럽게 올리고 800 × g에서 25분 원심분리합니다. 가운데 흰 층(PBMC)을 모아 생리식염수 또는 DPBS로 두 번 씻고 세포 수를 셉니다. 400 × g에서 10분 원심분리해 상층액을 버립니다.

동결 PBMC 준비 (Day -1)

1. 동결 PBMC는 하루 전에 녹여 24시간 안정화합니다. 37 °C 수조에서 녹인 뒤, 미리 데운 NkVita Basal Medium 20 mL를 천천히 한 방울씩 넣으며 섞습니다.
2. 300 × g에서 5분 원심분리해 상층액을 버리고, NK 확장 배지(5.1 조제)에 2 × 10⁶ cells/mL로 현탁해 플라스크에 넣고 37 °C에서 밤새 배양합니다.

NK 확장 배지 만들기

1. NkVita Basal Medium 1 L + NkVita Supplement-02 40 mL + IL-2(200 IU/mL)를 섞습니다.

NK 세포 확장

1. Day 0 (1차 활성화): 생존 PBMC 2 × 10⁷개(신선 또는 해동 24시간 후)를 준비합니다. NK Expansion Reagent A 1바이알을 녹여 원심분리 후 상층액을 버리고, 준비한 배지 20 mL로 현탁해 T75 플라스크에 옮깁니다. 37 °C, 5% CO₂에서 3일 배양합니다.
2. Day 3: NK 확장 배지 10 mL를 추가합니다.
3. Day 4–7: 배지 색과 세포 밀도를 보고 매일 배지를 더해 1.0–1.5 × 10⁶ cells/mL를 유지합니다. 전체 부피가 35 mL를 넘으면 T175 플라스크로 옮깁니다.
4. Day 7 (2차 활성화, 선택): NK Expansion Reagent B를 녹여 처리한 뒤 배양 부피를 200 mL로 맞추고 37 °C, 5% CO₂에서 3일 배양합니다. 시료 차이가 크므로 Day 7–9에 전체 세포 수가 20배로 늘었을 때만 진행합니다.
5. Day 8–13: 배지 추가 후 밀도가 1.0–1.5 × 10⁶ cells/mL가 되게 배지를 더합니다. 전체 부피가 200 mL를 넘으면 배양 백으로 옮기고, 이후에는 하루걸러 배지를 더합니다.
6. Day 14–15: 세포를 수확합니다. 보통 14일 또는 15일이 적기입니다.
7. 자세한 절차는 제품 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 4 °C, 운송 2–8 °C
• 운송·보관 중 침전이 생길 수 있으니 쓰기 전에 잘 흔들어 다시 섞습니다 (설명서).

함께 준비할 것

• 헤파린 나트륨 항응고 진공 채혈관 — 채혈용 권장 (설명서)
• 밀도 구배 분리액 (Ficoll) — PBMC 분리 (설명서)
• DPBS, 2% hPL 또는 자가 혈장 — 세포 세척 버퍼 (설명서)
• NK 확장 키트 — 처리 후 NK 확장 배양 (설명서는 NK Expansion Kit RP03030 표기)

사용 전 확인

1. 제대혈은 자가 혈장 사용에 영향을 주지 않도록 항응고제 비율을 30% 미만으로 유지합니다.
2. 채혈에는 헤파린 나트륨(heparin sodium) 항응고 진공 채혈관을 권장합니다.
3. 자가 혈장을 분리한 시료에 NK-MAX Purification Factor를 쓸 때는 세포 밀도가 5 × 10⁷ cells/mL를 넘지 않게 합니다.

신선 시료 처리 (말초혈액·제대혈 방법 동일)

1. 자가 혈장 분리(선택): 신선한 혈액을 800 × g에서 25분 원심분리(가속·감속 가장 느리게)하고 위층 혈장을 50 mL 튜브로 옮깁니다. 56 °C에서 30분 불활성화하고 1200 × g에서 10분 원심분리해 침전물을 없앤 뒤 4 °C에 보관합니다.
2. NK-MAX 처리: 혈장 분리 전 혈액 부피 1 mL당 12.5 µL를 혈액이 든 튜브에 넣고 피펫으로 잘 섞은 뒤 실온에서 20분 둡니다.
3. PBMC 분리: 남은 혈구층을 생리식염수와 1:1로 희석해 Ficoll 위에 올리고 900 × g에서 30분 원심분리합니다. 흰 경계층을 새 튜브로 옮겨 세척 버퍼(DPBS + 2% hPL 또는 자가 혈장)로 씻고 400 × g에서 10분 원심분리합니다. Ficoll이 다 없어질 때까지 세척을 반복합니다.
4. 분리한 PBMC는 바로 NK 활성화·확장에 쓰거나 보관합니다. 확장 절차는 NK 확장 키트 설명서를 따릅니다.
5. 자세한 절차는 제품 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 2–8 °C
• 유효기간 12개월 (설명서)

함께 준비할 것

• 동결 바이알 — 설명서
• 4 °C로 미리 식힌 동결 용기 또는 프로그램 냉동기 — 서서히 얼리기 (설명서)
• 액체질소 탱크 (≤ -135 °C) — 장기 보관 (설명서)
• 완전 배지 — 해동 후 재배양 (설명서). NK 세포는 예: ncKnight™ NK Expansion Factor Kit의 NK 완전 배지

면역세포 동결

1. 동결할 세포 수에 맞춰 동결 바이알에 이름을 붙입니다. 참고 밀도: NK 세포 1 × 10⁹ cells / 20 mL / vial, PBMC 1–1.5 × 10⁷ cells / mL / vial.
2. 대수 증식기의 세포를 모아 원심분리 튜브로 옮기고 원심분리합니다(참고 조건: 300 × g, 10분).
3. 상층액을 버리고 세포 펠릿에 Lymphocyte Cryopreservation Medium을 한 방울씩 떨어뜨려 넣은 뒤 부드럽게 섞어 고르게 현탁합니다.
4. 바이알에 나눠 담습니다.
5. 서서히 얼리기 방법 1: 4 °C로 미리 식힌 동결 용기에 바이알을 넣어 -80 °C 냉동고에 24시간 둔 뒤 액체질소 탱크(≤ -135 °C)로 옮깁니다.
6. 서서히 얼리기 방법 2: 프로그램 냉동기로 분당 -1 °C씩 -100 °C까지 내린 뒤 바로 액체질소 탱크(≤ -135 °C)로 옮깁니다.

해동 (NK 세포 예시)

1. 액체질소 탱크에서 바이알을 꺼내 드라이아이스에 담아 세포 배양실로 옮깁니다.
2. 37 °C 수조에서 살살 흔들며 빠르게 녹입니다.
3. 작은 얼음 조각만 남았을 때 꺼내 소독하고 생물안전작업대로 옮깁니다.
4. NK 세포를 적당량의 완전 배지에 현탁해 권장 밀도로 용기에 넣고 미리 데운 완전 배지를 더합니다. PBMC는 원심분리로 한 번 씻어 상층액을 버리고 배지에 다시 현탁해 1–2 × 10⁶ cells/mL로 넣습니다.
5. 십자 방향으로 부드럽게 흔들어 섞고 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣습니다.
6. 해동 후 바로 실험에 쓸 경우(NK 세포, PBMC 제외): 녹인 세포를 알맞은 용액에 옮겨 2.5–10 × 10⁷ cells/mL로 맞춥니다.
7. 자세한 절차는 제품 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.