Shownin hMSC (간엽줄기세포) 배양

• Basal Medium 2–8 °C, Supplement -80 °C 또는 -20 °C (공식 제품 페이지)
• 완전 배지는 2–8 °C에서 최대 2주 보관 (공식 제품 페이지·설명서)
• Supplement는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 냉동·해동은 2회를 넘기지 않습니다 (설명서)

함께 준비할 것

• hMSC Cryopreservation Medium — 세포 동결 시 (설명서 권장 시약)
• TrypLE Express Enzyme (1×), no phenol red — 세포 해리용 (설명서 권장 시약)
• DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 없음), 생리식염수 — 세척·세포 계수용 (설명서)
• 0.1% Type II collagenase, 70 μm·100 μm 세포 여과기 — 지방 조직 1차 분리 시 (설명서)
• T75/T175/T225 배양 플라스크, 15·50 mL 원심분리 튜브, 1.5·2 mL 동결 바이알 — 설명서 권장 소모품

완전 배지 만들기

1. Supplement를 4 °C에서 녹입니다(37 °C에서 녹이지 않음).
2. 생물안전작업대에서 Basal Medium 500 mL와 Supplement 25 mL를 멸균 피펫으로 섞습니다.
3. 완전 배지는 2–8 °C에 두고 2주 안에 씁니다.
4. 필요하면 Supplement를 5 mL씩 5개로 나눠 얼린 뒤, 5 mL를 Basal Medium 100 mL와 섞어 씁니다(냉동·해동 2회 이내).

지방 조직에서 hMSC 1차 분리 (설명서 예시)

1. 지방 조직은 4 °C로 운반해 24시간 안에 처리합니다.
2. DPBS(또는 생리식염수)로 혈액색이 없어질 때까지 씻고 약 1–2 mm³ 크기로 자릅니다.
3. 0.1% Type II collagenase로 37 °C에서 흔들며 45–60분 소화한 뒤 800 × g 10분 원심분리합니다. 아래층을 70 μm 세포 여과기로 거르고 600 × g 8분 원심분리, 세척(600 × g 5분)을 2회 합니다.
4. 완전 배지로 2 × 10⁴ cells/mL로 맞춰 T25 플라스크에 접종하고 37 °C, 5% CO₂에서 배양합니다.
5. 48시간 뒤 배지를 갈고 이후 3일마다 갈아 줍니다. 90% 컨플루언스에서 세포를 거둡니다.

계대 배양 (T75 기준)

1. 세포가 약 80–85% 컨플루언스일 때 계대합니다. 완전 배지와 해리 용액은 30분 전에 꺼내 실온에 맞춥니다.
2. 배지를 빼고 DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺ 없음)로 씻은 뒤 37 °C로 데운 TrypLE(표 참고)를 넣고 37 °C에서 5–7분 둡니다(중간에 움직이지 않음).
3. 같은 부피의 완전 배지로 중화하고 200 × g 5분 원심분리합니다.
4. 생리식염수 5 mL에 풀어 100 μm 여과기로 거른 뒤 세포를 셉니다(생존율 ≥90% 권장). 다시 200 × g 5분 원심분리합니다.
5. 완전 배지 5 mL에 풀어 6000–8000 cells/cm²로 접종하고 표의 부피만큼 완전 배지를 더합니다. 가로로 3번 흔들어 37 °C, 5% CO₂에서 3일 배양합니다.

해동과 동결

1. 해동: 37 °C 수조에서 작은 얼음 조각만 남을 때까지 녹이고, 15 mL 튜브로 옮겨 실온 완전 배지 10 mL를 한 방울씩 넣은 뒤 200 × g 5분 원심분리합니다. 완전 배지 5 mL에 풀어 세고 6000–8000 cells/cm²로 접종합니다.
2. 동결: 원심분리 후 동결 배지로 일정 밀도(예: 바이알당 2 × 10⁶ cells)로 풀어 프로그램 냉각 용기에 넣고 -80 °C에서 하룻밤 둔 뒤 다음 날 액체질소로 옮깁니다.

다른 배지에서 옮겨 올 때

1. 원래 배지로 세포를 회복 또는 계대한 뒤, 1일째에 NcMission™ hMSC Medium V3.0으로 배지를 바꿉니다. 1회 계대 후 새 배지에 적응합니다.
2. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• Basal Medium 2–8 °C, Supplement -80 °C 또는 -20 °C (공식 제품 페이지)
• 완전 배지는 2–8 °C에서 최대 2주 보관 (공식 제품 페이지·설명서)
• Supplement는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 냉동·해동은 2회를 넘기지 않습니다 (설명서)

함께 준비할 것

• hMSC Cryopreservation Medium — 세포 동결 시 (설명서 권장 시약)
• 해리 용액 (hMSC Mild Digestion Solution 또는 Trypsin/Trypsin Inhibitor) — 계대 시 (설명서). 별도 준비
• 75% 에탄올, 생리식염수, DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 없음), 100 µm 세포 여과기 — 조직 처리·세포 계수용 (설명서)
• T75/T175/T225 배양 플라스크, 15·50 mL 원심분리 튜브, 1.5·2 mL 동결 바이알, 동결 용기(Freezing Container) — 설명서 권장 소모품

완전 배지 만들기

1. Supplement를 4 °C에서 녹입니다(37 °C에서 녹이지 않음).
2. 생물안전작업대에서 Basal Medium (Phenol Red-free) 500 mL와 Supplement 25 mL를 섞습니다.
3. 완전 배지는 2–8 °C에 두고 2주 안에 씁니다. Supplement를 5 mL씩 나눠 얼렸다가 Basal Medium 100 mL와 섞어 써도 됩니다(냉동·해동 2회 이내).

탯줄 와튼 젤리 이식편 배양 (설명서 예시)

1. 탯줄은 Basal Medium에 담아 4 °C로 운반하고 24시간 안에 처리합니다.
2. 75% 에탄올에 2분 담근 뒤 생리식염수로 2–3회 씻어 혈액을 없애고 2–3 cm 길이로 자릅니다.
3. 정맥벽과 동맥 2개를 떼어 내고 상피가 섞이지 않게 와튼 젤리를 분리해 2–3 mm³ 크기로 잘게 자르고 무게를 잽니다.
4. 완전 배지에 풀어 표의 양대로 플라스크에 접종하고 37 °C, 5% CO₂, 포화 습도에서 배양합니다.
5. 5일째 첫 배지 교체, 9–10일째 두 번째 배지 교체(플라스크를 30° 세워 조직을 한쪽에 모은 뒤 상등액만 교체)를 합니다.
6. 약 12일째 계대합니다. 와튼 젤리 0.5 g/T75에서 약 2–3 × 10⁶ cells를 얻습니다.

계대 배양 (T75 기준)

1. 세포가 약 80–85% 컨플루언스일 때 계대합니다. 완전 배지와 hMSC Mild Digestion Solution을 실온에 맞춥니다.
2. 배지를 빼고 DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺ 없음)로 씻은 뒤 데운 해리 용액을 넣고 37 °C에서 4–5분 둔 다음, 같은 부피의 완전 배지로 중화하고 200 × g 5분 원심분리합니다.
3. 생리식염수 5 mL에 풀어 100 µm 여과기로 거른 뒤 셉니다(생존율 ≥90%). 다시 200 × g 5분 원심분리합니다.
4. 완전 배지 5 mL에 풀어 5000–7000 cells/cm²(권장 6000 cells/cm²)로 접종하고, 십자 방향으로 3번 흔들어 37 °C, 5% CO₂에서 3일 배양합니다.

해동·동결·배지 전환

1. 해동: 37 °C 수조에서 작은 얼음 조각만 남을 때까지 녹이고, 실온 완전 배지 10 mL를 한 방울씩 넣어 200 × g 5분 원심분리한 뒤 5 mL에 풀어 셉니다.
2. 동결: 원심분리 후 동결 배지에 일정 밀도로 풀어 프로그램 냉각 용기에 넣고 -80 °C에서 하룻밤 둔 뒤 액체질소로 옮깁니다.
3. 다른 배지에서 옮길 때: 원래 배지로 회복·계대한 뒤 1일째에 이 배지로 바꾸면 1회 계대 후 적응합니다.
4. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 2–8 °C (공식 제품 페이지·설명서 표 1)
• 유효기간 12개월 (설명서)

함께 준비할 것

• 동결 바이알 — 설명서
• 냉각 용기 또는 프로그램 냉각 장치 — 단계 냉각용 (설명서)
• 액체질소 보관 설비 (-135 °C 이하) — 장기 보관 (설명서)
• NcMission™ hMSC Medium V3.0 등 완전 배지 — 해동 후 세척·배양용. 공식 페이지 그림의 배양 배지

MSC 동결

1. 필요한 동결 바이알 수만큼 이름표를 붙입니다(참고: 1–5 × 10⁶ cells/mL/튜브).
2. 대수 증식기의 세포를 일반 방법으로 모아 원심분리합니다(참고: 200 × g 5분).
3. 상등액을 빼고 hMSC Cryopreservation Medium을 천천히 넣어 고르게 풉니다. 바이알에 나눠 담습니다.
4. 단계 냉각 ①: 4 °C로 미리 식힌 냉각 용기(예: Nalgene Mr. Frosty)에 넣어 -80 °C 냉동고에 24시간 둔 뒤, -135 °C 이하 액체질소 환경으로 옮깁니다.
5. 단계 냉각 ②: 또는 프로그램 냉각 장치로 -1 °C/분 속도로 -100 °C까지 내린 뒤 액체질소 환경(-135 °C 이하)으로 옮깁니다.

MSC 해동

1. 액체질소에서 꺼낸 바이알을 드라이아이스로 배양실까지 옮기고, 바로 37 °C 수조에서 흔들며 빠르게 녹입니다.
2. 작은 얼음 조각만 남으면 꺼내 소독하고 생물안전작업대로 옮깁니다.
3. 내용물을 15 mL 튜브로 옮기고 데운 배양 배지 약 9 mL를 천천히 넣어 섞습니다. 바이알을 배지 약 1 mL로 헹궈 같은 튜브에 합칩니다.
4. 원심분리(참고: 200 × g 5분)하고 상등액을 뺀 뒤 완전 배지 1–2 mL에 풉니다.
5. 원하는 밀도로 배양 용기에 옮기고 데운 완전 배지를 더한 뒤 십자 방향으로 흔들어 37 °C, 5% CO₂, 포화 습도에서 배양합니다.
6. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• Basal Medium 2–8 °C, Supplement -80 °C ~ -20 °C (공식 제품 페이지)

함께 준비할 것

• NcMission™ hMSC Medium V3.0 — 분화 전 hMSC 배양 (같은 계열 골·연골 분화 키트 설명서 기준. 이 키트 설명서는 확인되지 않음)

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• Basal Medium 2–8 °C, Supplement -80 °C ~ -20 °C (공식 제품 페이지)
• 완전 분화 배지는 2–8 °C에서 2주 안에 사용 (설명서)
• Supplement는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 냉동·해동은 2회를 넘기지 않습니다 (설명서)

함께 준비할 것

• NcMission™ hMSC Medium V3.0 — 분화 전 hMSC 배양·펠릿 형성 (설명서 권장)
• TrypLE (0.5×로 희석해 사용) — 펠릿 형성 전 해리 (설명서)
• Alcian Blue 8GX 염색 용액 — 연골 기질 염색 (설명서)
• 4% PFA 용액, DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 없음) — 고정·세척 (설명서)
• 동결 절편용 포매제·절편기, 슬라이드 — 펠릿 절편 제작 (설명서)
• 6-well plate, 15 mL 원심분리 튜브, 피펫 — 설명서 권장 소모품

완전 분화 배지 만들기

1. Chondrogenesis Differentiation Supplement를 4 °C에서 녹입니다(37 °C에서 녹이지 않음).
2. 생물안전작업대에서 Basal Medium과 Supplement를 섞어 완전 분화 배지 100 mL를 만듭니다. 혼합량은 제품과 함께 받은 최신 설명서를 따릅니다.
3. 완전 배지는 4 °C에 두고 2주 안에 씁니다. 보관·사용 중 빛을 피합니다.

MSC 준비

1. hMSC를 NcMission™ hMSC Medium V3.0으로 배양합니다(자세한 내용은 그 제품 설명서).
2. 6-well plate에 5,000–10,000 cells/cm²로 접종하고 십자 방향으로 3번 흔들어 37 °C, 5% CO₂에서 배양합니다.

펠릿 만들기 (약 80% 컨플루언스)

1. 웰당 0.5× TrypLE 1 mL로 37 °C에서 3분 해리합니다.
2. 250 × g 5분 원심분리(가속 3, 감속 7) 후 NcMission hMSC Medium에 풀어 셉니다.
3. 15 mL 튜브에 2 × 10⁵ cells씩 옮깁니다(군당 2개). 1 mL보다 적으면 NcMission hMSC Medium으로 1 mL를 맞추고 실온 300 × g 5분 원심분리합니다.
4. 상등액을 빼고 튜브를 가볍게 두드려 펠릿을 푼 뒤 튜브당 완전 배지 1 mL에 풀어 실온 450 × g 10분 원심분리합니다.
5. 뚜껑을 느슨하게 하고 37 °C, 5% CO₂에서 16시간(하룻밤) 둡니다.

연골 분화 유도와 확인

1. 1일째: 펠릿이 흩어지지 않게 NcMission hMSC Medium을 빼고, 연골 분화 완전 배지를 튜브당 2 mL씩 벽을 따라 천천히 넣습니다.
2. 10–20일 배양하며 2일마다 튜브당 2 mL씩 배지를 갈아 줍니다(14일이면 연골 형성에 충분).
3. 고정: DPBS 2 mL로 씻고 4% PFA 2 mL로 25 °C에서 10분 고정합니다.
4. 동결 절편: 포매제에 묻어 10 μm 두께로 자릅니다(포매 시료는 -80 °C에서 최대 2개월 보관).
5. DPBS로 10분씩 2회 씻고 말린 뒤 Alcian Blue 8GX 용액으로 37 °C 습윤 상자에서 30분 염색합니다.
6. 흐르는 물로 3분 헹구고(시료에 물줄기가 직접 닿지 않게) 말려 현미경으로 관찰합니다.
7. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• Basal Medium 2–8 °C, Supplement -80 °C ~ -20 °C (공식 제품 페이지)
• 완전 분화 배지는 2–8 °C에서 2주 안에 사용 (설명서)
• Supplement는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 냉동·해동은 2회를 넘기지 않습니다 (설명서)

함께 준비할 것

• NcMission™ hMSC Medium V3.0 — 분화 전 hMSC 배양·대조군 배지 (설명서 권장)
• 2% Alizarin Red S 용액 — 칼슘 침착 염색 (설명서)
• 4% 파라포름알데히드(PFA), DPBS (Ca²⁺/Mg²⁺ 없음) — 고정·세척 (설명서)
• Matrigel 코팅 플레이트 — 세포 탈락 방지용 권장 (설명서)
• 6-well plate, 피펫, 15·50 mL 원심분리 튜브 — 설명서 권장 소모품

완전 분화 배지와 염색액 만들기

1. Osteogenic Differentiation Supplement를 4 °C에서 녹입니다(37 °C에서 녹이지 않음).
2. 생물안전작업대에서 Basal Medium과 Supplement를 섞어 완전 분화 배지 100 mL를 만듭니다. 혼합량은 제품과 함께 받은 최신 설명서를 따릅니다.
3. 완전 배지는 4 °C에 두고 2주 안에 씁니다.
4. Alizarin Red 염색액: 2% 원액(실온 보관)을 탈이온수로 1:20 희석해 0.1% 작업액을 만듭니다(연갈색 투명액).

MSC 준비

1. hMSC를 NcMission™ hMSC Medium V3.0으로 배양합니다(자세한 내용은 그 제품 설명서).
2. 6-well plate에 5000–10000 cells/cm²로 접종하고 십자 방향으로 3번 흔들어 37 °C, 5% CO₂에서 배양합니다.

골 분화와 확인

1. 세포가 약 85% 컨플루언스가 되면 배지를 빼고 두 군으로 나눠, 한 군에는 골 분화 완전 배지, 다른 군(대조군)에는 NcMission™ hMSC Medium V3.0을 넣습니다.
2. 분화 중 세포 가장자리가 말리거나 떨어지는 것을 막으려면 Matrigel로 코팅한 플레이트를 권장합니다.
3. 3–4일마다 웰당 2–3 mL씩 배지를 갈아 주며 21일째까지 배양합니다.
4. 21일째 상등액을 빼고 4% PFA로 30분 고정합니다.
5. Alizarin Red 작업액을 넣고 실온·빛 차단 상태에서 20–60분 염색한 뒤, 생리식염수나 DPBS로 여러 번 씻고 담가 둔 채 현미경으로 관찰합니다.
6. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

함께 준비할 것

• 전용 세포 회수용 용해 버퍼(dedicated lysis buffer) — 세포 회수 시 (브로셔). 제품명·품목코드 미확인
• MSC 배양 배지 — 브로셔는 NcMission 배지가 2D·3D 배양 모두에 쓰인다고 표기