Shownin hPSC (iPSC · ESC) 배양 · 분화

• Basal Medium: 2–8 °C
• Supplement A·B: -80 °C 또는 -20 °C
• Supplement A·B는 4 °C에서 녹입니다(37 °C에서 녹이지 않음). 사용량에 맞춰 나눠 얼리고, 얼렸다 녹이기는 2회를 넘기지 않습니다(설명서).
• 완전 배지: 2–8 °C에서 2주까지 (공식 제품 페이지·설명서)

함께 준비할 것

• 배양 기질: Vitronectin — 코팅용. ncLaminin511 또는 Matrigel도 사용 가능 (공식 제품 페이지)
• 배양 기질: ncLaminin511 — 코팅용 (공식 제품 페이지)
• hPSC Dissociation Buffer — EDTA 계대·동결 전 해리 (설명서 권장 품목)
• ROCK 억제제 Blebbistatin (10 mM) — 해동·계대 후 완전 배지에 1:4000 첨가 (설명서 권장 품목)
• hPSC Cryopreservation Medium — hPSC 동결 (설명서 권장 품목)
• DMEM/F12 배지 — Matrigel 희석, 해동 시 세척 (설명서)
• DPBS (칼슘·마그네슘 무첨가) — 계대·동결 전 세척 (설명서)
• 6-well plate, 피펫, 15/50 mL 원심분리 튜브, 1.5/2 mL 동결 바이알, 세포 동결 용기 — 설명서 표 2

완전 배지 만들기

1. NcTarget™ Supplement A·B를 4 °C에서 녹입니다. 37 °C에서 녹이지 않습니다.
2. 생물안전작업대에서 Basal Medium 400 mL, Supplement A 20 mL, Supplement B 80 mL를 섞어 완전 배지 500 mL를 만듭니다(100 mL는 80 / 4 / 16 mL, 50 mL는 40 / 2 / 8 mL).
3. 완전 배지는 4 °C에 두고 2주 안에 씁니다. 보충제는 사용량에 맞춰 나눠 얼리고 얼렸다 녹이기를 2회 넘기지 않습니다.
4. 배지는 그때그때 필요한 양만 데워 온도 변화와 성분 분해를 줄입니다.

Matrigel 코팅 (6-well plate 예)

1. 권장 코팅 농도는 0.013 mg/cm²입니다. Matrigel 3 mg 1개 분량이 6-well plate 4장에 해당합니다.
2. 4 °C에서 녹인 Matrigel 3 mg에 차가운 DMEM/F12 1 mL를 넣어 섞은 뒤, 차가운 DMEM/F12 36 mL가 든 50 mL 튜브에 옮겨 고루 섞습니다.
3. 6-well plate 4장에 1.5 mL/well씩 넣고 고르게 펴지게 기울입니다.
4. 실온에서 1시간 또는 4 °C에서 하룻밤 둔 뒤 씁니다. 4 °C에서 2주 안에 쓸 수 있습니다.

hPSC 해동

1. 코팅한 6-well plate를 생물안전작업대에서 1시간 두어 실온(15–30 °C)으로 맞춥니다.
2. 완전 배지 4 mL에 Blebbistatin(10 mM) 1 µL(1:4000)를 넣고 실온으로 맞춥니다. 37 °C 수조에서 데우지 않습니다.
3. 동결 바이알을 37 °C 수조에서 얼음 결정이 거의 사라질 때까지(1분 이내) 녹입니다.
4. 세포를 15 mL 튜브로 옮기고 DMEM/F12 10 mL를 천천히 넣어 섞은 뒤 160 × g에서 5분 원심분리합니다.
5. 상층액을 버리고 Blebbistatin을 넣은 완전 배지 4 mL에 부드럽게 현탁해, 코팅액을 뺀 2개 well에 2 mL/well씩 접종합니다.
6. 판을 가로·세로로 3회 흔들어 고루 펴고 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣은 뒤 다시 3회 흔듭니다.
7. 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 바꾸고, 이후 매일 배지를 교체합니다.

EDTA 계대 (6-well plate 예)

1. 세포 밀도가 약 85%일 때(보통 접종 4일 후) 계대합니다. 밀도가 낮아도 5일을 넘겨 배양하지 않습니다. 계대 비율은 1:5–1:20, 상태가 좋으면 1:10을 권장합니다.
2. 코팅한 판을 약 1시간 실온(~25 °C)에 둡니다. 완전 배지 2 mL/well에 Blebbistatin(10 mM)을 1:4000(2 mL당 0.5 µL)으로 넣어 실온으로 맞춥니다.
3. 배지를 빼고 칼슘·마그네슘이 없는 DPBS 2 mL/well로 가볍게 헹군 뒤 뺍니다.
4. hPSC Dissociation Buffer 2 mL/well을 넣고 37 °C 배양기에서 7–8분 둡니다. 대부분의 세포가 밝고 둥글어졌지만 아직 떨어지지 않았을 때 멈춥니다.
5. 판을 흔들지 않고 꺼내 해리 버퍼를 빼고, Blebbistatin을 넣은 완전 배지 2 mL/well을 바로 넣어 판을 가로·세로로 흔들어 세포를 떼어 냅니다. 피펫팅은 1–2회만 하고 긁지 않습니다.
6. 세포가 EDTA 버퍼에 15분 넘게 머물지 않게 하고, 한 번에 6-well plate 1장만 다룹니다.
7. 새 코팅 판의 코팅액을 빼고 Blebbistatin을 넣은 완전 배지 2 mL/well을 넣은 뒤, 정한 비율대로 세포 현탁액을 나눠 넣습니다.
8. 판을 가로·세로로 3회 흔들어 배양기에 넣고, 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 바꿉니다. 이후 매일 배지를 바꾸고 4–5일 뒤 다시 계대하거나 동결합니다.

hPSC 동결과 배지 전환

1. 세포 밀도가 약 85%일 때 동결합니다. 보통 6-well plate 1 well에서 살아 있는 세포 2–4 × 10⁶개를 얻어 바이알 1개에 얼립니다.
2. hPSC 동결 배지를 실온으로 맞추고 잘 섞습니다(DMSO가 바닥에 가라앉기 쉬움).
3. DPBS 2 mL/well로 헹군 뒤 hPSC Dissociation Buffer 2 mL/well로 37 °C에서 7–8분 해리하고 버퍼를 뺍니다.
4. 동결 배지 1 mL/well을 넣어 부드럽게 현탁하고 1.5/2 mL 동결 바이알로 옮깁니다.
5. 세포 동결 용기에 넣어 -80 °C에서 하룻밤 둔 뒤 다음 날 액체질소로 옮깁니다(또는 프로그램 냉동기 사용).
6. 다른 영양세포 무사용 배지에서 옮길 때는 기존 배지로 계대하고 24시간 뒤 기존 배지와 NcTarget™ 완전 배지를 1:1로 섞은 배지로 바꾸고, 이 혼합 배지로 2회 계대한 뒤 NcTarget™ 완전 배지로 완전히 바꿉니다. 2–3회 계대하면 적응하며, 적응 후 동결할 수 있습니다.
7. 자세한 절차와 문제 해결은 제품 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• Basal Medium: 2–8 °C
• 125× Supplement: -80 °C 또는 -20 °C. 4 °C에서 녹이고(37 °C 금지), 필요하면 0.8 mL씩 나눠 얼립니다. 얼렸다 녹이기는 2회를 넘기지 않습니다(설명서).
• 완전 배지: 2–8 °C에서 2주까지 (공식 제품 페이지·설명서)

함께 준비할 것

• 배양 기질: Vitronectin — 코팅용, 설명서 기본 절차 (설명서 권장 품목). ncLaminin511 또는 Matrigel도 사용 가능 (공식 제품 페이지)
• 배양 기질: ncLaminin511 — 코팅용 (공식 제품 페이지)
• hPSC Dissociation Buffer — EDTA 계대·동결 전 해리 (설명서 권장 품목)
• ROCK 억제제 Blebbistatin (10 mM) — 해동·계대 후 완전 배지에 1:4000 첨가 (설명서 권장 품목)
• hPSC Cryopreservation Medium — hPSC 동결 (설명서 권장 품목)
• DMEM/F12 배지 — 코팅액 희석, 해동 시 세척 (설명서)
• DPBS (칼슘·마그네슘 무첨가) — 계대·동결 전 세척 (설명서)
• 6-well plate, 피펫, 15/50 mL 원심분리 튜브, 1.5/2 mL 동결 바이알, 세포 동결 용기 — 설명서 표 2

완전 배지 만들기

1. NcEpic™ hPSC Medium Supplement를 4 °C에서 녹입니다. 37 °C에서 녹이지 않습니다.
2. 생물안전작업대에서 Basal Medium 496 mL와 Supplement 4 mL를 섞어 완전 배지 500 mL를 만듭니다.
3. 나눠 쓰려면 Supplement를 0.8 mL씩 5개로 나눠 얼리고, 1개를 녹여 Basal Medium 99.2 mL와 섞어 100 mL를 만듭니다.
4. 완전 배지는 4 °C에 두고 2주 안에 씁니다. 그때그때 필요한 양만 데웁니다.

Vitronectin 코팅 (6-well plate 예)

1. Vitronectin을 실온(15–25 °C)에서 녹입니다. 녹인 뒤에는 4 °C에서 2주까지 두거나, 나눠서 -20 °C/-80 °C에 보관합니다.
2. 6-well plate(10 cm²/well) 1장에 60 µg(500 µg/mL 원액 120 µL)을 씁니다. 120 µL씩 나눠 얼려 두면 편합니다.
3. 120 µL(60 µg) 1개를 DMEM/F12 9 mL에 넣어 부드럽게 섞습니다(볼텍스 금지).
4. 1.5 mL/well씩 넣고 고르게 펴지게 기울인 뒤 실온(15–25 °C)에서 1시간 이상 둡니다.
5. 쓰기 직전에 코팅액을 빼고 바로 씁니다(추가 세척 불필요, 바닥을 긁지 않음). 밀봉해 4 °C에서 1주까지 둘 수 있고, 쓰기 전 실온에 10–30분 둡니다. 코팅액이 마르면 세포 부착이 나빠집니다.

Matrigel 코팅 (6-well plate 예)

1. 권장 코팅 농도는 0.013 mg/cm²로, 6-well plate(9.6 cm²/well) 1장에 0.75 mg입니다. 3 mg 1개 분량이 4장에 해당합니다.
2. 4 °C에서 녹인 Matrigel 3 mg에 차가운 DMEM/F12 1 mL를 넣어 섞은 뒤, 차가운 DMEM/F12 36 mL가 든 50 mL 튜브에 옮겨 고루 섞습니다.
3. 6-well plate 4장에 1.5 mL/well씩 넣고 고르게 펴지게 기울입니다.
4. 실온에서 1시간 또는 4 °C에서 하룻밤 둔 뒤 씁니다. 4 °C에서 2주 안에 쓸 수 있습니다.

hPSC 해동

1. 코팅한 6-well plate를 생물안전작업대에서 1시간 두어 실온(15–30 °C)으로 맞춥니다.
2. 완전 배지 4 mL에 Blebbistatin(10 mM) 1 µL(1:4000)를 넣고 실온으로 맞춥니다. 37 °C 수조에서 데우지 않습니다.
3. 동결 바이알을 37 °C 수조에서 얼음 결정이 거의 사라질 때까지(1분 이내) 녹입니다.
4. 세포를 15 mL 튜브로 옮기고 DMEM/F12 10 mL를 천천히 넣어 섞은 뒤 160 × g에서 5분 원심분리합니다.
5. 상층액을 버리고 Blebbistatin을 넣은 완전 배지 4 mL에 부드럽게 현탁해, 코팅액을 뺀 2개 well에 2 mL/well씩 접종합니다.
6. 판을 가로·세로로 3회 흔들어 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣고 다시 3회 흔듭니다. 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 바꾸고, 이후 매일 교체합니다.

EDTA 계대 (6-well plate 예)

1. 세포 밀도가 약 85%일 때(보통 접종 4일 후) 계대합니다. 밀도가 낮아도 5일을 넘겨 배양하지 않습니다. 계대 비율은 1:5–1:20, 상태가 좋으면 1:10을 권장합니다.
2. Vitronectin 코팅 판을 약 1시간 실온(~25 °C)에 둡니다. 완전 배지 2 mL/well에 Blebbistatin(10 mM)을 1:4000(2 mL당 0.5 µL)으로 넣어 실온으로 맞춥니다.
3. 배지를 빼고 칼슘·마그네슘이 없는 DPBS 2 mL/well로 가볍게 헹군 뒤 뺍니다.
4. hPSC Dissociation Buffer 2 mL/well을 넣고 37 °C 배양기에서 7–8분 둡니다. 대부분의 세포가 밝고 둥글어졌지만 아직 떨어지지 않았을 때 멈춥니다.
5. 판을 흔들지 않고 꺼내 해리 버퍼를 빼고, Blebbistatin을 넣은 완전 배지 2 mL/well을 바로 넣어 판을 가로·세로로 흔들어 세포를 떼어 냅니다. 피펫팅은 1–2회만 하고 긁지 않습니다(10–15%가 남는 것은 정상).
6. 세포가 해리 버퍼에 15분 넘게 머물지 않게 하고, 한 번에 6-well plate 1장만 다룹니다.
7. 새 코팅 판의 코팅액을 빼고 Blebbistatin을 넣은 완전 배지 2 mL/well을 넣은 뒤, 정한 비율대로 세포 현탁액을 나눠 넣습니다.
8. 판을 가로·세로로 3회 흔들어 배양기에 넣고, 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 바꿉니다. 이후 매일 교체하고 4–5일 뒤 다시 계대하거나 동결합니다.

hPSC 동결과 배지 전환

1. 세포 밀도가 약 85%일 때 동결합니다. 보통 6-well plate 1 well에서 살아 있는 세포 2–4 × 10⁶개를 바이알 1개에 얼립니다.
2. hPSC Cryopreservation Medium을 실온으로 맞추고 잘 섞습니다(DMSO가 바닥에 가라앉기 쉬움). DPBS로 헹군 뒤 hPSC Dissociation Buffer 2 mL/well로 37 °C에서 7–8분 해리하고 버퍼를 뺍니다.
3. 동결 배지 1 mL/well로 부드럽게 현탁해 동결 바이알로 옮기고, 세포 동결 용기에 넣어 -80 °C에서 하룻밤 둔 뒤 다음 날 액체질소로 옮깁니다.
4. 다른 영양세포 무사용 배지에서 옮길 때는 기존 배지와 NcEpic™ 완전 배지를 1:1로 섞어 2회 배지 교체한 뒤, NcEpic™ 완전 배지로 2–3회 계대해 적응시킵니다.
5. 자세한 절차와 문제 해결은 제품 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 -80 °C 또는 -20 °C (공식 제품 페이지·설명서)
• 녹인 뒤에는 4 °C에서 2주까지 두거나, 나눠서 -20 °C/-80 °C에 보관합니다. 얼렸다 녹이기를 반복하지 않습니다(NcEpic™ hPSC Medium 설명서).
• 코팅한 판은 밀봉해 4 °C에서 1주 안에 씁니다(설명서).

함께 준비할 것

• DMEM/F12 배지 — Vitronectin 희석용, 6-well plate 1장에 9 mL (설명서)
• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 함께 쓰는 hPSC 배지 (공식 제품 페이지·설명서)
• 15 mL 원심분리 튜브 — 희석용 (설명서)

나눠 담기

1. 권장 코팅량은 1 µg/cm²입니다. 6-well plate는 well당 10 cm²로 10 µg, 1장(60 cm²)에 60 µg이 필요합니다.
2. 60 µg은 원액(500 µg/mL) 120 µL에 해당합니다. 120 µL(60 µg)씩 나눠 담아 -20 °C 또는 -80 °C에 보관합니다.
3. 필요할 때 1개를 꺼내 6-well plate 1장을 코팅합니다. 다른 용기는 아래 표의 양을 씁니다.
4. 얼렸다 녹이기를 반복하지 않습니다(NcEpic™ hPSC Medium 설명서).

코팅 (6-well plate 예, 다른 용기도 같은 방법)

1. Vitronectin 1개(120 µL, 60 µg)를 실온(15–25 °C)에서 녹입니다.
2. 15 mL 튜브에 DMEM/F12 9 mL를 넣고 녹인 Vitronectin을 옮겨 부드럽게 섞습니다. 볼텍스하지 않습니다.
3. 희석액은 바로 코팅에 씁니다. 6-well plate에 1.5 mL/well씩 넣습니다.
4. 판을 부드럽게 기울여 희석액이 바닥 전체를 덮게 합니다.
5. 실온(15–25 °C)에서 1시간 이상 둔 뒤 씁니다. 바로 쓰지 않으면 밀봉해 4 °C에서 1주 안에 쓰고, 쓰기 전 실온에 10–30분 둡니다.
6. 세포를 넣기 직전 판을 기울여 피펫 팁으로 코팅액을 뺍니다. 바닥을 긁지 않게 하고, 헹구거나 다른 용액을 더 넣지 않습니다.
7. 이어서 hPSC 해동·계대는 NcEpic™ 또는 NcTarget™ hPSC Medium 설명서 절차를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 -80 °C 또는 -20 °C (공식 제품 페이지). 설명서 표기와 다르므로 제품 라벨과 COA를 함께 확인하세요.
• 300 µL(30 µg)씩 나눠 얼려 보관합니다(설명서).
• 코팅한 판은 밀봉해 4 °C에서 1주 안에 씁니다(설명서).

함께 준비할 것

• DPBS (칼슘·마그네슘 무첨가) — ncLaminin511 희석용, 6-well plate 1장에 9 mL (설명서)
• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 함께 쓰는 hPSC 배지 (각 배지 공식 제품 페이지)
• 15 mL 원심분리 튜브 — 희석용 (설명서)

나눠 담기

1. 권장 코팅량은 0.5 µg/cm²입니다. 6-well plate는 well당 10 cm²로 5 µg, 1장(60 cm²)에 30 µg이 필요합니다.
2. 30 µg은 원액(100 µg/mL) 300 µL에 해당합니다. 300 µL(30 µg)씩 나눠 담아 얼려 보관합니다.
3. 필요할 때 1개를 녹여 DPBS로 희석해 6-well plate 1장을 코팅합니다.
4. 다른 배양 용기는 아래 표의 양(0.5 µg/cm² 기준)을 씁니다.

코팅 (6-well plate 예, 다른 용기도 같은 방법)

1. ncLaminin511 1개(300 µL, 30 µg)를 실온(15–25 °C)에서 녹입니다.
2. 15 mL 튜브에 칼슘·마그네슘이 없는 DPBS 9 mL를 넣고 녹인 ncLaminin511을 옮겨 부드럽게 섞습니다. 볼텍스하지 않습니다.
3. 희석한 작업 용액을 6-well plate에 1.5 mL/well씩 넣습니다.
4. 판을 부드럽게 흔들어 작업 용액이 바닥 전체에 고르게 퍼지게 합니다.
5. 실온(15–25 °C)에서 1시간 이상 둔 뒤 씁니다. 바로 쓰지 않으면 밀봉해 4 °C에서 1주 안에 쓰고, 쓰기 전 실온에 30분 둡니다.
6. 세포를 넣기 직전 판을 기울여 피펫(또는 팁)으로 코팅액을 뺍니다. 바닥을 긁지 않게 하고, 추가로 헹구지 않습니다.
7. 이어서 hPSC 해동·계대는 NcEpic™ 또는 NcTarget™ hPSC Medium 설명서 절차를 따릅니다.

• 보관 2–8 °C (공식 제품 페이지·설명서)
• 유효기간 12개월 (설명서)
• 쓰기 전 실온으로 맞춥니다(설명서).

함께 준비할 것

• DPBS (칼슘·마그네슘 무첨가) — 해리 전 세척, 2 mL/well (설명서)
• hPSC 완전 배지 (NcEpic™ hPSC Medium) — 해리 후 세포 회수·재접종 (설명서)
• hPSC 완전 배지 (NcTarget™ hPSC Medium) — 해리 후 세포 회수·재접종 (설명서)
• ROCK 억제제 Blebbistatin — 완전 배지에 2.5 µM 첨가 (설명서). Y-27632 10 µM도 가능
• 코팅 판 (Vitronectin 또는 Matrigel) — 재접종용 (설명서)

EDTA 해리와 계대 (6-well plate 예)

1. 배양 배지를 빼고 칼슘·마그네슘이 없는 DPBS 2 mL/well을 넣어 가볍게 흔든 뒤 뺍니다.
2. hPSC Dissociation Buffer 2 mL/well을 넣어 바닥 전체를 덮습니다.
3. 37 °C 배양기에서 7–8분 둡니다. 판은 배양기 금속 선반에 바로 올려 고르게 데우고, 겹쳐 쌓지 않습니다.
4. 현미경으로 보아 대부분의 세포가 밝고 둥글어졌지만 아직 바닥에서 떨어지거나 뜨지 않았을 때 해리를 멈춥니다. 변화가 적으면 시간을 늘립니다.
5. 판을 흔들지 않게 생물안전작업대로 옮겨, 기울여서 해리 버퍼를 뺍니다.
6. ROCK 억제제(Blebbistatin 2.5 µM 또는 Y-27632 10 µM)를 넣은 미리 데운 hPSC 완전 배지(NcEpic™ 또는 NcTarget™) 2 mL/well을 바로 넣고, 판을 가로·세로로 흔들어 세포를 떼어 냅니다. 피펫팅은 1–2회만 하고 단일세포로 흩지 않습니다.
7. 세포를 긁지 않습니다. 10–15%가 바닥에 남는 것은 정상입니다. 한 번에 6-well plate 1장만 다루고, 해리 버퍼 처리 시간이 15분을 넘지 않게 합니다.
8. Matrigel 또는 Vitronectin 코팅 판의 코팅액을 빼고 ROCK 억제제를 넣은 완전 배지 2 mL/well을 넣은 뒤, 정한 계대 비율대로 세포 현탁액을 나눠 넣습니다.
9. 판을 가로·세로로 3회 흔들어 배양기(37 °C, 5% CO₂)에 넣고 다시 3회 흔듭니다. 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 바꾸고, 이후 매일 교체해 4–5일 뒤 계대하거나 수확합니다.
10. 자세한 절차는 제품 설명서와 NcEpic™·NcTarget™ hPSC Medium 설명서를 확인하세요.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 -20 °C (공식 제품 페이지)
• -20 °C에서 2년, 해동 후 4 °C에서 2개월 (설명서)
• 4 °C에서 밤새 또는 실온(15–25 °C)에서 녹이고, 37 °C에서 녹이지 않습니다. 녹인 뒤 부드럽게 섞고, 필요하면 나눠 담아 둡니다 (설명서)

함께 준비할 것

• DPBS(칼슘·마그네슘 없음) — 해리 전 세척, 2 mL/well (설명서)
• DMEM/F12 — 해리 후 재부유, 2 mL/well (설명서)
• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 해리 후 hPSC 재접종용 배양 배지
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin — 단일세포 계대 당일 hPSC 생존 · 부착 보조, 최종 2.5 µM (Blebbistatin 설명서)

해동

1. 4 °C에서 밤새 또는 실온(15–25 °C)에서 녹입니다. 37 °C에서 녹이지 않습니다.
2. 녹인 뒤 부드럽게 섞습니다. 필요하면 나눠 담아 둡니다.
3. 해동한 용액은 4 °C에서 최대 2개월, 장기 보관은 -20 °C에서 최대 2년입니다.

단일세포 해리 (6-well plate의 hiPSC 예)

1. 세포가 약 85% 찼을 때 해리합니다. DPBS(칼슘·마그네슘 없음) 2 mL/well로 1회 세척합니다.
2. Solase 1 mL/well을 넣고 37 °C 배양기에서 5–8분 둡니다.
3. plate를 배양기 금속 선반에 바로 닿게 두어 고르게 데우고, 겹쳐 쌓지 않습니다.
4. 해리 시간은 기질(예: Matrigel, Vitronectin)과 세포 종류에 따라 조금 다릅니다. plate를 가볍게 두드려 세포가 떨어지면 해리가 끝난 것입니다.
5. DMEM/F12 2 mL/well을 넣어 세포를 재부유하고 200 × g에서 5분 원심합니다.
6. 원심 후 필요에 따라 세포 계수 또는 계대를 진행합니다. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 2–8 °C (공식 제품 페이지 · 설명서 표 1)
• 유효기간 12개월 (설명서)
• 사용 전 실온으로 맞추고 가볍게 흔들어 섞습니다 (설명서). DMSO가 바닥에 가라앉을 수 있어 충분히 섞어야 합니다 (NcEpic™ hPSC Medium 설명서)

함께 준비할 것

• hPSC Dissociation Buffer — 동결 전 해리, 2 mL/well, 37 °C 7–8분 (설명서)
• NcEpic™ hPSC Medium — 해동 후 재부유 · 배양용 hPSC 완전 배지 (설명서)
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 완전 배지 (설명서)
• Vitronectin — 해동 세포를 접종할 plate 코팅 (설명서)
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin (10 mM) — 해동 배지에 1:4000 첨가 (설명서)
• DPBS(칼슘·마그네슘 없음), DMEM/F12 — 세척 · 희석용 일반 시약 (설명서)
• 1.5/2 mL 동결 튜브, 서서히 냉각 용기 또는 프로그램 냉동기 — 동결 장비 (설명서)

hPSC 동결 (6-well plate 예)

1. 세포가 약 85% 찼을 때 수확합니다. 보통 1 well에서 생세포 2–4 × 10⁶개, 동결 튜브 1개 분량입니다.
2. 동결 배지를 4 °C에서 꺼내 실온으로 맞추고 가볍게 흔들어 섞습니다. 1.5/2 mL 동결 튜브를 준비합니다.
3. 배지를 빼고 DPBS(칼슘·마그네슘 없음) 2 mL/well로 헹군 뒤 빼냅니다.
4. hPSC Dissociation Buffer 2 mL/well을 넣고 37 °C에서 7–8분 둔 뒤, 해리액을 조심해서 빼냅니다.
5. 동결 배지 1 mL/well을 넣고 부드럽게 피펫팅한 뒤, plate를 가로·세로로 3번 흔들어 동결 튜브로 옮깁니다.
6. 서서히 냉각 용기에 넣어 -80 °C에서 하룻밤 두고 다음 날 액체질소로 옮깁니다. 프로그램 냉동기를 써도 됩니다.

hPSC 해동 (6-well plate 예)

1. Vitronectin 코팅 6-well plate를 생물안전작업대에서 약 1시간 두어 실온(15–30 °C)으로 맞춥니다.
2. hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget) 4 mL에 Blebbistatin(10 mM) 1 µL를 넣고(1:4000) 실온으로 맞춥니다. 37 °C 수조에서 데우지 않습니다.
3. 동결 튜브를 37 °C 수조에서 1분 안에 녹이고, 얼음 결정이 거의 안 보이면 꺼냅니다.
4. 75% 에탄올로 닦고 15 mL 튜브로 옮긴 뒤 DMEM/F12 10 mL를 한 방울씩 섞으며 넣고 160 × g에서 5분 원심합니다.
5. 상층액을 버리고 Blebbistatin이 든 완전 배지 4 mL로 재부유합니다(위아래 피펫팅은 피함).
6. 코팅액을 뺀 2 well에 2 mL씩 접종하고 가로·세로로 흔들어 37 °C · 5% CO₂에서 배양합니다.
7. 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 바꾸고 이후 매일 교체합니다. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 2–8 °C (공식 제품 페이지). 설명서 보관 조건은 4 °C
• 유효기간 6개월 (설명서)
• 사용 전 버퍼를 실온으로 맞춥니다 (설명서 권장 재료 표)

함께 준비할 것

• 전기천공 장비 (Amaxa Nucleofector II · IIb 등) 및 호환 큐벳 · 플라스틱 드로퍼 — 설명서가 지정한 장비와 프로그램 B016이 필요합니다 (설명서 표 2 · 전기천공 절차)
• Solase — 전기천공 전 단일세포 해리, 6-well 1 mL/well, 37 °C 5–10분 (설명서)
• NcEpic™ hPSC Medium — 전기천공 전후 hPSC 배양 (설명서)
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 배지 (설명서)
• Matrigel 또는 Vitronectin 코팅 배양 용기 — 전기천공 후 세포를 받을 배양 기질 (설명서)
• ROCK 억제제 — 전기천공 후 세포를 받을 배지에 첨가 (설명서 '배양 배지 + ROCK inhibitor')
• 플라스미드 DNA (0.5–1 µg/µL, A260/A280 약 1.80) — 사용자가 준비 (설명서)
• DPBS, DMEM/F12 — 세척 · 해리 정지 · 재부유용 일반 시약 (설명서)

전기천공 전 hPSC 준비

1. hPSC는 1:10–1:20으로 4일마다 계대하고 매일 배지를 갈아 줍니다. 세포가 80–90% 찼을 때 전기천공을 권장합니다.
2. Matrigel 같은 feeder-free 체계의 hPSC는 실온으로 데운 Solase로 37 °C에서 5–10분 해리합니다.
3. 데운 DMEM/F12를 넣어 해리를 멈추고, 5 mL 피펫으로 1–2회 피펫팅해 단일세포 현탁액을 만듭니다.
4. feeder 체계에서 키운 세포는 전기천공 전에 Matrigel로 한 번 계대해 80–90%까지 키운 뒤 같은 방법으로 해리합니다.

전기천공 (6-well plate 1 well 기준)

1. 전기천공 장비를 준비하고 프로그램 B016으로 설정합니다. Solase(6-well 1 mL/well)와 DMEM/F12(3 mL/well)를 실온으로 데웁니다.
2. Matrigel 코팅 plate 각 well에 배양 배지 + ROCK 억제제 2 mL를 넣고 37 °C에서 미리 평형시킵니다.
3. 1.5 mL 튜브에 플라스미드 DNA 1–5 µg(총 10 µL 이하)을 넣고, 버퍼 100 µL를 더해 섞은 뒤 짧게 원심해 모읍니다.
4. 세포는 DPBS 2 mL/well로 헹군 뒤 Solase 1 mL/well, 37 °C 5–10분으로 해리하고, DMEM/F12 2 mL/well을 넣어 1–2회 피펫팅합니다.
5. 15 mL 튜브에 모아 120 × g에서 4분 원심하고, DMEM/F12 약 1 mL/well로 재부유해 계수한 뒤 튜브당 2–4 × 10⁶개로 나눕니다.
6. 8초간 짧게 원심해 세포를 모으고 상층액을 제거한 뒤, 준비한 버퍼 · 플라스미드 혼합액을 넣고 튜브 바닥을 가볍게 두드려 섞습니다(피펫팅 금지).
7. 전기천공 큐벳으로 옮기고 거품을 뺀 뒤 B016 프로그램을 실행합니다. 이 단계부터는 빠르고 부드럽게 진행합니다.
8. 평형시킨 plate에서 배지 약 500 µL를 큐벳 벽을 따라 넣어 섞고, 해당 well로 조심해서 옮깁니다. 37 °C 배양기에 두고 16–24시간 뒤 유전자 발현을 확인합니다. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 -80 °C ~ -20 °C (공식 제품 페이지 · 설명서)
• 4 °C에서 녹입니다. 37 °C에서 녹이지 않습니다 (설명서)
• 반복 동결 · 해동을 피하고, 필요하면 나눠 담아 보관합니다 (설명서)

함께 준비할 것

• 기본 배지 (사용자 실험에 맞는 기저 배지) — 이 제품은 보충제이며 배지는 포함되지 않습니다. 1×가 되도록 희석해 씁니다 (설명서)
• hPSC-mDAP Differentiation Kit — 공식 그림의 예시 세포인 hPSC 유래 도파민 신경 전구세포(mDAP)를 얻는 키트
• Solase — 신경 전구세포 계대 시 세포 해리 (관련 hPSC 분화 키트 설명서)

사용 방법

1. 실험 목적에 맞는 품목(비타민 A 포함 · 비타민 A 무첨가 · 인슐린 무첨가)을 고릅니다.
2. 보충제를 4 °C에서 녹입니다. 37 °C에서 녹이지 않습니다.
3. 50× 농축이므로, 준비한 배지에 1×가 되도록 희석합니다(예: 배지 49 mL + 보충제 1 mL).
4. 반복 동결 · 해동을 피합니다. 필요하면 나눠 담아 보관합니다.
5. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보관 -20 °C (공식 제품 페이지)
• -20 °C에서 빛을 피해 보관하고 반복 동결 · 해동을 피하면 6개월 안정 (설명서)
• 4 °C에서는 빛을 피해 최대 1개월 (설명서)

함께 준비할 것

• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — Blebbistatin을 넣어 쓸 hPSC 완전 배지 (설명서)
• hPSC Dissociation Buffer — hPSC 계대용 해리 시약 (hPSC 배지 설명서 절차)
• Solase — 단일세포 해리가 필요할 때 (관련 설명서)
• Vitronectin — 계대 · 해동 세포를 받을 배양 기질 (설명서)

hPSC 계대 시 사용

1. 계대 당일, hPSC 완전 배지에 Blebbistatin을 최종 2.5 µM로 넣습니다(완전 배지 2 mL에 10 mM 원액 0.5 µL).
2. 이 배지로 세포를 접종하면 배양면 부착이 좋아집니다(설명서 그림 1-A).
3. 24시간 뒤 Blebbistatin이 없는 hPSC 완전 배지로 바꾸고, 평소 조건으로 배양합니다(설명서 그림 1-B).

동결 세포 해동 시 사용

1. hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget) 4 mL에 Blebbistatin(10 mM) 1 µL를 넣습니다(1:4000).
2. 배지를 실온(15–30 °C)으로 맞춥니다. 37 °C 수조에서 데우지 않습니다.
3. 해동 · 원심한 세포를 이 배지로 재부유해 Vitronectin 코팅 plate에 접종합니다.
4. 18–24시간 뒤 새 완전 배지로 교체합니다.

배아체(EB) 형성 실험

1. 배아체 형성 실험에서는 Blebbistatin 농도 10 µM을 권장합니다.
2. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보충제(Supplement) A–E: -80 °C 또는 -20 °C
• 기저 배지(Basal Medium) F: 2–8 °C
• 만든 완전 배지는 2–8 °C(4 °C)에서 최대 2주 (설명서)
• 보충제는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 필요하면 나눠 얼리고, 동결·해동은 2회를 넘기지 않습니다 (설명서)

함께 준비할 것

• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 분화 시작 전 hPSC 유지 배양용. 설명서는 Day 0에 hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget)를 제거하고 분화를 시작한다고 적고 있습니다. 해동 후 5계대 이상 지난 hPSC 사용 권장 (설명서).
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 배지 (설명서 권장 시약)
• Corning® Matrigel® Matrix — 분화 단계 배양 기질(코팅). 키트에 없음 (설명서·공정 모식도)
• hPSC Dissociation Buffer — hPSC 계대용 (설명서 권장 시약)
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin (10 mM) — 설명서 권장 시약
• DMEM/F12, DPBS(칼슘·마그네슘 없음) — 세척·희석용 일반 시약 (설명서)
• Solase — Day 10 계대와 MSC 수확 시 세포 해리 (설명서)
• NcMission™ hMSC Medium V3.0 — 설명서 권장 시약. 동결 전 재부유에 '무혈청 hMSC 배지'를 씁니다
• hMSC Cryopreservation Medium — hPSC-MSC 동결 보존, 2 × 10⁶ cells/mL (설명서)
• hPSC Cryopreservation Medium — hPSC 동결용 (설명서 권장 시약)

완전 배지 만들기

1. 보충제 A–E를 4 °C에서 녹입니다(37 °C 금지).
2. 생물안전작업대에서 기저 배지 F에 보충제를 1×가 되도록 섞어 완전 배지 A, B, C, D, E를 각각 만듭니다(A–D는 10×, E는 30× 원액).
3. 바로 쓰거나 4 °C에서 2주 안에 씁니다.

hPSC 준비 (Day -2 ~ Day -1)

1. hPSC는 해동 후 5계대 이상 지난 세포를 씁니다.
2. 6-well plate에 4 × 10⁵ cells/well로 접종해 2일 배양합니다. 다른 용기는 4 × 10⁴ cells/cm², 배지 200 µL/cm².
3. Day -1에 같은 방식으로 새 6-well plate에 접종합니다.

분화 유도 (Day 0 ~ Day 8)

1. Day 0 (접종 24–36시간 후): hPSC 배지(NcEpic 또는 NcTarget)를 빼고 DMEM/F12로 2회 세척한 뒤 완전 배지 A 2 mL/well.
2. Day 2 (배지 A 교체 40시간 후): DMEM/F12로 1회 세척 후 완전 배지 B 2 mL/well.
3. Day 3 (24시간 후): 완전 배지 C 2 mL/well (세척 불필요). Day 4에 배지 C를 한 번 더 교체합니다.
4. Day 6: 완전 배지 D 2 mL/well, Day 8: 완전 배지 E 2 mL/well (세척 불필요).
5. Day -1 ~ Day 3의 배지 교체 시각은 엄격히 지켜야 합니다(설명서 권장 예: 오전 11시 계대 → 30시간 뒤 배지 A).

계대와 P0 수확 (Day 10 ~ Day 14)

1. Day 10: DPBS 2 mL/well로 1회 세척 → Solase 2 mL, 37 °C·5% CO₂에서 3–5분 → 200 × g 5분 원심 → 완전 배지 E로 재부유해 1:4로 계대하고 배지 E로 계속 배양합니다(공정 모식도상 이후 기질 없음).
2. Day 11: 완전 배지 E 2 mL/well로 교체.
3. Day 13–14: 세포가 가득 차면 P0 hPSC 유래 MSC입니다. P0는 동결할 수 있습니다.
4. P1은 5,000 cells/cm²로 계대하고, P2 세포부터 연구에 씁니다.

동결 보존

1. DPBS 2 mL/well로 헹군 뒤 Solase 2 mL, 37 °C 3–5분 → 15 mL 튜브에 모아 200 × g 5분 원심.
2. 무혈청 hMSC 배지 1 mL/well로 재부유해 세포 수를 셉니다.
3. hMSC Cryopreservation Medium에 2 × 10⁶ cells/mL로 재부유해 액체질소에 보관합니다.
4. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 기저 배지(Basal Medium): 2–8 °C
• 보충제(Supplement): -80 °C ~ -20 °C
• 만든 완전 배지는 2–8 °C(4 °C)에서 최대 2주 (설명서)
• 보충제는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 나눠 얼릴 수 있으며 동결·해동은 2회 이내 (설명서)

함께 준비할 것

• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 분화 시작 전 hPSC 유지 배양용. 설명서는 Day 0에 hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget)를 제거하고 분화를 시작한다고 적고 있습니다.
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 배지 (설명서 권장 시약)
• Corning® Matrigel® Matrix — 분화 단계 배양 기질(코팅). 키트에 없음 (설명서·공정 모식도)
• hPSC Dissociation Buffer — hPSC 계대용 (설명서 권장 시약)
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin (10 mM) — 설명서 권장 시약
• DMEM/F12, DPBS(칼슘·마그네슘 없음) — 세척·희석용 일반 시약 (설명서)
• Solase — Day 0 hPSC 해리, Day 11 mDAP 수확, 유지 배양 후 회수 (설명서)
• Vitronectin — 설명서 권장 시약 (hPSC 배양 기질)
• ncLaminin511 — mDAP 유지·mDAN 성숙용 코팅 (PLO/Laminin 대신 사용 가능, 설명서)
• Poly-L-ornithine + Laminin — mDAN 성숙용 PLO/Laminin 코팅 (설명서)
• hPSC-mDAP Maintenance Medium (RP01017-H) · hPSC-mDAN Maturation Medium (RP01017-I) — mDAP 유지·mDAN 성숙 단계용. 공식 페이지에 별도 품목으로 표시
• Dopaminergic Neuron Electrophysiology Medium (RP01017-J) — 전기생리 기록 전 3일 배양용 (설명서에 언급, 공식 페이지에 없음)
• TrypLE — 성숙 신경세포 분석용 해리 (설명서)
• hPSC Cryopreservation Medium — hPSC 동결용 (설명서 권장 시약)

완전 배지 만들기

1. 보충제 A–E와 기저 배지 F를 4 °C에서 녹입니다(37 °C 금지).
2. 기저 배지 F에 보충제(100×)를 1×가 되도록 섞어 완전 배지 A–E를 만듭니다.
3. 새로 만들어 쓰는 것을 권장하며, 4 °C에서 2주 안에 씁니다.

mDAP 분화 (Day 0 ~ Day 11)

1. Day 0: hPSC가 약 85% 차면 DPBS로 1회 헹군 뒤 Solase 2 mL/well, 37 °C·5% CO₂에서 5–8분 해리 → 미니 원심분리 10–15초.
2. hPSC 2 × 10⁶개를 미리 데운 완전 배지 A 8 mL에 넣고 Blebbistatin(10 mM) 8 µL(1:1000)를 섞어, Matrigel 코팅 6-well plate 4 well에 2 mL/well씩 접종합니다(5 × 10⁵ cells/well; 다른 용기는 5 × 10⁴ cells/cm²).
3. Day 1–3 완전 배지 B, Day 3–5 배지 C, Day 5–7 배지 D, Day 7–11 배지 E — 모두 2 mL/well, 매일 교체.
4. Day 11: DPBS로 헹군 뒤 Solase 1 mL/well, 37 °C에서 8–10분 → DPBS 1 mL/well로 모아 178 × g 5분 원심. 이 세포가 mDAP입니다.

mDAP 동결과 해동·유지

1. 동결: mDAP Cryopreservation Medium G에 5 × 10⁶ cells/mL로 맞춰 1 mL/바이알 → 서서히 얼리는 용기에 넣어 -80 °C, 다음 날 액체질소로 옮깁니다.
2. 해동: Matrigel 또는 ncLaminin511 코팅 6-well plate 준비. mDAP Maintenance Medium에 Blebbistatin 1:2000(최종 5 µM)을 넣습니다.
3. 37 °C 수조에서 1분 안에 녹이고, DMEM/F12 10 mL를 한 방울씩 넣어 섞은 뒤 178 × g 5분 원심.
4. 1 × 10⁵ cells/cm², 배지 0.2 mL/cm²로 접종 → 18–24시간 뒤 유지 배지 3 mL/well로 교체, 이후 2일마다 교체. 해동 4–5일째 Solase(5–8분)로 회수해 성숙 단계에 씁니다.

mDAN 성숙 배양

1. 코팅(24-well plate): PLO — 차가운 멸균수 12 mL에 Poly-L-ornithine(10 mg/mL) 4.8 µL, 500 µL/well, 4 °C 하룻밤 → 다음 날 DPBS로 헹굼 → Laminin — 차가운 DPBS 12 mL에 Laminin(1 mg/mL) 48 µL, 500 µL/well, 4 °C. 또는 ncLaminin511(100 µg/mL) 240 µL를 DPBS 12 mL에 섞어 500 µL/well.
2. 해동 후 4–5일 된 mDAP를 Blebbistatin(5 µM)이 든 mDAP Maintenance Medium으로 재부유해 5 × 10⁵ cells/cm²(설명서 표기)로 접종합니다.
3. 18–24시간 뒤 hPSC-mDAN Maturation Medium 0.5 mL/well로 교체, 처음 7일은 매일, 이후 2일마다 교체합니다.
4. 성숙 20–30일 후 성숙 표지자 분석, 40–50일 후 전기생리 분석이 가능합니다(전기생리 기록 전 Dopaminergic Neuron Electrophysiology Medium(RP01017-J)으로 3일 배양).
5. 분석용 단일세포 해리는 TrypLE, 37 °C 10–15분(15분 초과 금지). 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보충제(Supplement) A–D: -80 °C 또는 -20 °C
• 기저 배지 E, 동결 배지 F: 2–8 °C
• 만든 완전 배지는 2–8 °C(4 °C)에서 2주 안에 사용 (설명서)
• 보충제는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 동결·해동은 2회 이내 (설명서)

함께 준비할 것

• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 분화 시작 전 hPSC 유지 배양용. 설명서는 Day 0에 hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget)를 제거하고 분화를 시작한다고 적고 있습니다.
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 배지 (설명서 권장 시약)
• Corning® Matrigel® Matrix — 분화 단계 배양 기질(코팅). 키트에 없음 (설명서·공정 모식도)
• hPSC Dissociation Buffer — hPSC 계대용 (설명서 권장 시약)
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin (10 mM) — 설명서 권장 시약
• DMEM/F12, DPBS(칼슘·마그네슘 없음) — 세척·희석용 일반 시약 (설명서)
• Solase — Day 0 hPSC 해리, Day 9 MNP 해리 (설명서)
• ncLaminin511 또는 Poly-L-ornithine/Laminin — Day 9 이후 Laminin 코팅 (설명서 권장 시약)
• Motor Neuron Maturation Medium (RP01018-G) — 동결 MNP를 해동해 성숙시킬 때 (설명서, 별도 품목)
• Motor Neuron Electrophysiology Medium (RP01018-H) — 전기생리 기록 전 3일 배양 (설명서에 언급, 공식 페이지에 없음)
• TrypLE — 성숙 신경세포 분석용 해리 (설명서)

완전 배지 만들기

1. 보충제 A–D를 4 °C에서 녹입니다(37 °C 금지).
2. 기저 배지 E에 보충제 A(20×)/B(25×)/C(50×)/D(50×)를 1×가 되도록 섞어 완전 배지 A–D를 만듭니다.
3. 바로 쓰는 것을 권장하며, 4 °C에서 2주 안에 씁니다.

NEP 분화 (Day 0 ~ 4)

1. hPSC가 80–90% 차면 hPSC 배지를 빼고 DPBS 2 mL/well로 헹굽니다.
2. 미리 데운 Solase 1 mL/well, 37 °C·5% CO₂에서 5–7분 → 1.5 mL 튜브에서 10–15초 원심 → 완전 배지 A 1 mL로 단일세포 재부유 후 계수.
3. Matrigel 코팅 6-well plate에 3–5 × 10⁵ cells/well, 완전 배지 A 2 mL(Blebbistatin 10 µM 포함)로 접종하고 십자 방향으로 3번 흔들어 고르게 폅니다.
4. 22–24시간 뒤 Blebbistatin 없는 완전 배지 A 2 mL/well로 교체, 이후 매일 교체합니다.

MNP 분화 (Day 4 ~ 9)

1. Day 4부터 완전 배지 B 2 mL/well, 매일 교체 (Day 4–9).

pMN 분화 (Day 9 ~ 12)

1. Day 9: DPBS로 헹군 뒤 Solase 1 mL/well, 37 °C에서 8–12분(덜 떨어지면 18–20분까지, 20분 초과 금지) → 10–15초 원심 → 완전 배지 C 1 mL로 재부유 후 계수.
2. 이 단계의 MNP는 Motor Neuron Cryopreservation Medium F 1 mL에 2 × 10⁶ cells/튜브로 동결할 수 있습니다.
3. Matrigel(2배 농도) 또는 Laminin 코팅 12-well plate에 2–6 × 10⁵ cells/well, 완전 배지 C 1 mL/well(Blebbistatin 10 µM)로 접종.
4. 22–24시간 뒤 Blebbistatin 없는 배지 C 1 mL/well로 교체, 매일 교체(Day 9–12). 운동 신경세포는 잘 떨어지므로 부드럽게 다룹니다.

성숙 (Day 12 ~ 35)

1. Day 12부터 완전 배지 D 1 mL/well로 교체하며 배양합니다(본문은 매일 교체).
2. Day 30–35에 성숙 운동 신경세포를 얻어 분석합니다. 전기생리 기록 전에는 Motor Neuron Electrophysiology Medium(RP01018-H)으로 3일 배양합니다.

동결 MNP 해동·성숙

1. 완전 배지 C에 Blebbistatin 1:1000(최종 10 µM)을 넣고 실온으로 맞춥니다.
2. 37 °C 수조에서 1분 안에 녹이고 DMEM/F12 10 mL를 한 방울씩 넣어 섞은 뒤 178 × g 5분 원심.
3. Matrigel 또는 Laminin 코팅 12-well plate에 2–6 × 10⁵ cells/well로 접종 → 22–24시간 뒤 배지 C 1 mL/well로 교체, 3일 배양.
4. 해동 Day 3부터 완전 배지 D 1 mL/well, 2일마다 교체. 해동 후 Day 18–23에 성숙 운동 신경세포를 얻습니다.
5. 분석용 해리는 TrypLE 37 °C 10–15분(15분 초과 금지), qPCR은 2 × 10⁶개 이상에서 RNA 추출. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보충제(Supplement) A–D: -80 °C 또는 -20 °C
• Medium E: 2–8 °C
• 만든 완전 배지는 2–8 °C(4 °C)에서 최대 2주 (설명서)
• 보충제는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 동결·해동은 2회 이내 (설명서)

함께 준비할 것

• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 분화 시작 전 hPSC 유지 배양용. 설명서는 Day 0에 hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget)를 제거하고 분화를 시작한다고 적고 있습니다. 해동 후 5계대 이상 지난 hPSC 사용 권장 (설명서).
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 배지 (설명서 권장 시약)
• Corning® Matrigel® Matrix — 분화 단계 배양 기질(코팅). 키트에 없음 (설명서·공정 모식도)
• hPSC Dissociation Buffer — hPSC 계대용 (설명서 권장 시약)
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin (10 mM) — 설명서 권장 시약
• DMEM/F12, DPBS(칼슘·마그네슘 없음) — 세척·희석용 일반 시약 (설명서)
• 0.25% Trypsin Solution · Trypsin Inhibitor (Shownin RP02011 · RP02012) — Day 8 3D 전환 시 세포 해리·중지 (설명서 권장 시약)
• POLY HEMA, T25 플라스크, 3D 회전 배양기(15 rpm) — 3D 오가노이드 배양 (설명서)
• Solase — 설명서 권장 시약
• hPSC Cryopreservation Medium — hPSC 동결용 (설명서 권장 시약)
• hPSC-Nephron Cell Differentiation Medium (RP01015-F) — 동결 세포 해동 후 이어 분화할 때 (설명서, 별도 품목)

완전 배지 만들기

1. 보충제 A–D를 4 °C에서 녹입니다(37 °C 금지).
2. Medium E에 보충제 A/B/C/D(100×)를 1×가 되도록 섞어 완전 배지 A–D를 만듭니다.
3. 바로 쓰거나 4 °C에서 2주 안에 씁니다.

hPSC 준비 (Day -3)

1. 24-well plate에 hPSC 3–5 × 10⁴ cells/well로 접종하고 매일 배지를 교체합니다(설명서 Tips: 5 × 10⁴ cells/cm², hPSC 완전 배지 200 µL/cm²).
2. 해동 후 5계대 이상 지난 hPSC 사용을 권장합니다.

2D 분화 (Day 0 ~ 18/21)

1. Day 0: hPSC가 50% 차면 hPSC 배지를 빼고 DPBS 500 µL로 1회 세척 → 완전 배지 A 0.5 mL/well, 매일 교체(Day 0–4). 50% 도달 시점에 맞춰 시작일을 조정합니다.
2. Day 4–6 완전 배지 B, Day 6–8 배지 C, Day 8–10 배지 D, Day 10–13 배지 C — 모두 1 mL/well, 매일 교체. Day 4 무렵 세포가 수축하며, 너무 느슨하거나 촘촘하면 이후 분화 효율에 영향이 있습니다.
3. Day 13부터 Nephron Differentiation Medium E 1 mL/well, 매일 교체. 약 5–7일 뒤(Day 18–21) 성숙한 네프론 상피 구조를 얻습니다.

3D 분화 (Day 8 ~ 15/17)

1. Day 0–8은 2D와 같습니다.
2. Day 8: 완전 배지 D 6 mL에 Blebbistatin 1:1000을 넣어 준비. 24-well 1 well에 0.25% 트립신 500 µL, 37 °C 3분 → 트립신 억제제 500 µL로 중지 → 피펫으로 풀어 5–10초 원심.
3. Blebbistatin이 든 배지 D로 재부유해 POLY HEMA 코팅 T25 플라스크에 옮기고 3D 회전 배양기 15 rpm에서 배양. 24시간 뒤 Blebbistatin 없는 배지로 바꾸고 매일 교체(Day 8–10).
4. Day 10–13 완전 배지 C 6 mL, Day 13부터 Medium E 5 mL, 매일 교체. 약 2–4일 뒤(Day 15–17) 구조가 뚜렷한 신장 오가노이드를 얻습니다.

동결 세포 해동 후 이어 분화

1. 2D: Matrigel 코팅 24-well plate 준비, 완전 배지 C 1 mL에 Blebbistatin 1:2000(최종 5 µM). 37 °C에서 1분 안에 녹여 Medium E 8 mL를 한 방울씩 넣고 150 × g 5분 원심 → 배지 C 1 mL로 1 well에 접종.
2. 해동 Day 2–4 배지 D, Day 4–7 배지 C, Day 7부터 Medium E — 5–7일 뒤 성숙 신장 상피 구조.
3. 3D: 배지 C 6 mL + Blebbistatin 1:1000으로 같은 방법으로 해동 → POLY HEMA 코팅 T25, 15 rpm. 해동 Day 1–3 배지 D 6 mL, Day 3–6 배지 C 6 mL, Day 6부터 Medium E 5 mL — 2–4일 뒤 신장 오가노이드.
4. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.

• 보충제(Supplement) A–C: -80 °C 또는 -20 °C
• Basal Medium D·E, Purification Buffer F, Cryopreservation Medium G: 2–8 °C
• 만든 완전 배지는 2–8 °C(4 °C)에서 최대 2주 (설명서)
• 보충제는 4 °C에서 녹이고 37 °C에서 녹이지 않습니다. 동결·해동은 2회 이내 (설명서)

함께 준비할 것

• NcEpic™ hPSC Medium 또는 NcTarget™ hPSC Medium — 분화 시작 전 hPSC 유지 배양용. 설명서는 Day 0에 hPSC 완전 배지(NcEpic 또는 NcTarget)를 제거하고 분화를 시작한다고 적고 있습니다. 해동 후 5계대 이상 지난 hPSC 사용 권장 (설명서).
• NcTarget™ hPSC Medium — NcEpic™ 대신 쓸 수 있는 hPSC 배지 (설명서 권장 시약)
• Corning® Matrigel® Matrix — 분화 단계 배양 기질(코팅). 키트에 없음 (설명서·공정 모식도)
• hPSC Dissociation Buffer — hPSC 계대용 (설명서 권장 시약)
• ROCK Inhibitor-Blebbistatin (10 mM) — 설명서 권장 시약
• DMEM/F12, DPBS(칼슘·마그네슘 없음) — 세척·희석용 일반 시약 (설명서)
• 0.25% Trypsin Solution · Trypsin Inhibitor (Shownin RP02011 · RP02012) — RPE 수확·동결 시 해리와 중지 (설명서 권장 시약)
• Solase — 설명서 권장 시약
• hPSC Cryopreservation Medium — hPSC 동결용 (설명서 권장 시약)
• RPE 성숙 배지 (RP01016-H) — 동결 RPE 해동 후 성숙 배양 (설명서, 별도 품목)

완전 배지 만들기

1. 보충제 A, B, C를 4 °C에서 녹입니다(37 °C 금지).
2. 완전 배지 A·B: Basal Medium D에 보충제 A 또는 B(50×)를 1×로. 완전 배지 C: Basal Medium E에 보충제 C(50×)를 1×로 섞습니다(예: Basal E 98 mL + 보충제 C 2 mL).
3. 바로 쓰거나 4 °C에서 2주 안에 씁니다.

hPSC 준비 (Day -2)

1. hPSC가 85% 차면 계대해 12-well plate에 1 × 10⁵ cells/well로 접종하고 2일 배양, 매일 배지 교체(다른 용기는 2 × 10⁴ cells/cm²).
2. 5계대 이상 지나 상태가 좋은 hPSC로 분화를 시작합니다.

분화 (Day 0 ~ 23)

1. Day 0–5: 완전 배지 A 1 mL/well, 매일 교체.
2. Day 6–15: 완전 배지 B 1 mL/well, 매일 교체.
3. Day 16–23: 완전 배지 C 1 mL/well, 매일 교체.

정제와 성숙 (Day 23 ~ 45)

1. Day 23: 배지를 빼고 DPBS 1 mL/well로 1회 세척 → RPE Purification Buffer F 1 mL, 37 °C·5% CO₂에서 6–8분. 섬유아세포 모양의 이질 세포가 바닥에서 완전히 떨어지게 합니다(현미경으로 보며 손으로 살짝 흔들면 빨라짐).
2. 떠오른 이질 세포를 빨아내고 DPBS 1 mL/well로 3회 씻습니다.
3. 완전 배지 C 2 mL/well로 Day 35–45까지 배양, 3–4일마다 교체. 이 시기의 RPE를 연구에 씁니다.

동결과 해동

1. 동결: DPBS로 세척 → 0.25% 트립신 1 mL, 37 °C 3–5분(세포 대부분이 밝게 보이면 중지) → 트립신 제거 후 트립신 억제제 1 mL, 3–5회 피펫팅 → 180 × g 5분 원심 → RPE Cryopreservation Medium G로 재부유해 예: 3 × 10⁶ cells/튜브로 동결.
2. 해동: Matrigel 코팅 6-well plate 준비, RPE 성숙 완전 배지 6 mL에 Blebbistatin(10 mM) 6 µL(1:1000). 37 °C에서 1분 안에 녹이고 DMEM/F12 10 mL를 한 방울씩 넣어 180 × g 5분 원심.
3. Blebbistatin이 든 성숙 배지 6 mL로 재부유해 6-well 2 well에 3 mL/well로 접종(권장 1–2 × 10⁵ cells/cm²).
4. 18–24시간 뒤 교체, 이후 2일마다 3 mL/well. 해동 Day 8 무렵 전형적 RPE 형태, Day 10 무렵 멜라닌 분비가 뚜렷해집니다. 자세한 절차는 제품 설명서를 따릅니다.

제조사가 공개한 시험 결과입니다. 표시한 시료 · 조건에서 얻은 값이며, 사용하시는 세포 · 공정에서 같은 결과를 보장하지 않습니다.