엔도톡신 시험을 계획할 때 확인할 것

엔도톡신 시험이 확인하는 것

엔도톡신 시험(Bacterial Endotoxins Test, BET)은 그람음성균에서 나온 엔도톡신을 검출하거나 정량하는 시험입니다.[1][9] 전통적으로는 투구게 혈구 추출물(LAL, limulus amoebocyte lysate)을 시약으로 씁니다.[1][9]

세 가지 시험법과 판정 기준

• 겔화법(gel-clot): 시약이 엉기는지로 판정합니다.[1][2]
• 비탁법(turbidimetric)과 발색법(chromogenic): 빛으로 측정하는 방법이며, 각각 종말점(end-point)법과 동력학(kinetic)법으로 나뉩니다.[1][2]

미국약전(USP <85>), 유럽약전(Ph. Eur. 2.6.14), 일본약전(JP 4.01)의 엔도톡신 시험은 ICH Q4B Annex 14에 따라 조건을 지키면 ICH 지역에서 서로 바꿔 쓸 수 있습니다.[2][3] 세 방법 중 어느 것을 써도 되지만, 결과에 이견이 있으면 겔화법으로 최종 판정합니다.[1][3]

한도와 최대 유효 희석배수(MVD)

주사제의 엔도톡신 한도는 투여량을 기준으로 K/M으로 계산합니다. M은 체중 1 kg당 최대 투여량이고, K는 척수강 내 투여가 아니면 5 EU/kg, 척수강 내 투여면 0.2 EU/kg입니다.[1][4]

최대 유효 희석배수(MVD)는 엔도톡신 한도를 판정할 수 있는 가장 큰 희석배수이며, 「엔도톡신 한도 × 시료 농도 ÷ 시약 감도(λ)」로 구합니다.[1][5] 방해를 피하려고 시료를 묽힐 때도 MVD를 넘으면 안 됩니다. 넘어서 묽히면 한도를 넘는 시료도 적합으로 나올 수 있기 때문입니다.[1][5]

방해 시험(억제·증강)

시료 성분이 시약 반응을 억제하거나 증강하지 않는지 먼저 확인해야 합니다. 광학적 방법에서는 시료에 넣은 엔도톡신의 측정값이 넣은 양의 50~200% 안에 들어야 합니다.[1][5] 시약 공급처나 제조 방법, 제형이 바뀌면 이 확인을 다시 합니다.[1][18] 시약이나 시험 기관을 바꿀 때는 미리 승인한 계획서에 따라 같은 로트 시료로 두 방법을 비교 시험하는 방식이 쓰입니다.[18][14]

단백질 의약품에서 주의할 점: 낮은 회수(LER)

킬레이트제(예: 시트르산)와 계면활성제(예: 폴리소르베이트)가 함께 든 바이오의약품 제형에서는, 넣어 둔 엔도톡신이 보관 시간이 지나면서 잘 검출되지 않는 「낮은 회수(low endotoxin recovery, LER)」가 보고되어 있습니다.[15][16][17] PDA 기술보고서 No. 82(2019)는 LER의 기전과 함께 보관 시간 시험(hold-time study) 설계 지침을 다룹니다.[15][17] 따라서 이런 제형은 방해 시험을 통과했더라도, 실제 보관 조건과 시간에서 엔도톡신이 회수되는지 따로 확인할 필요가 있습니다.[15][16]

새 시약과 바뀐 규정

• 유럽약전: 재조합 C인자(rFC) 시험 장 2.6.32가 Supplement 10.3으로 공개되어 2021년 1월 1일부터 적용되었습니다. 이 방법은 시험할 물질·제품에 맞는지(적합성)를 보인 뒤 LAL 방법처럼 쓸 수 있습니다.[9][10]
• 미국약전: 재조합 시약(rFC, 재조합 캐스케이드 시약)을 쓰는 장 <86>이 2024년 7월 승인되었고 2025년 5월 공식이 되었습니다. <85>를 대신하는 장이 아니라 추가 선택지이며, LAL을 쓰던 곳은 그대로 써도 됩니다.[6][7][8]
• 유럽약전은 토끼 발열성 시험을 각 조항에서 빼고 새 일반 장 5.1.13(발열성)을 두었습니다. 2025년 7월 1일부터 적용되며, 제조자가 위험 평가를 바탕으로 단핵구 활성화 시험 같은 시험관 시험을 고릅니다.[11][12]
• 미국 FDA는 「Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers」 2판(최종)을 2026년 3월에 냈습니다. 2012년 첫판을 고친 판이므로 미국 제출 자료는 2판 기준으로 다시 확인합니다.[13][14]

시험 계획 점검표

출처