エンドトキシン試験を計画するときに確認すること

エンドトキシン試験で確認すること

エンドトキシン試験（Bacterial Endotoxins Test、BET）は、グラム陰性菌由来のエンドトキシンを検出または定量する試験です。[1][9] 従来はカブトガニの血球抽出物（LAL、limulus amoebocyte lysate）を試薬として用います。[1][9]

3つの試験法と判定の基準

• ゲル化法（gel-clot）：試薬がゲル化するかどうかで判定します。[1][2]
• 比濁法（turbidimetric）と比色法（chromogenic）：光で測定する方法で、それぞれエンドポイント（end-point）法とカイネティック（kinetic）法に分かれます。[1][2]

ICH Q4B Annex 14 により、条件を満たせば、米国薬局方（USP <85>）、欧州薬局方（Ph. Eur. 2.6.14）、日本薬局方（JP 4.01）のエンドトキシン試験は ICH 地域で相互に利用できます。[2][3] 3つの方法のどれを使ってもよいものの、結果に疑義や争いがある場合はゲル化法で最終判定します。[1][3]

限度値と最大有効希釈倍数（MVD）

注射剤のエンドトキシン限度値は投与量に基づき K/M で計算します。M は体重 1 kg あたりの最大投与量で、K は髄腔内投与以外では 5 EU/kg、髄腔内投与では 0.2 EU/kg です。[1][4]

最大有効希釈倍数（MVD）は、エンドトキシン限度値を判定できる最大の希釈倍数で、「エンドトキシン限度値 × 試料濃度 ÷ 試薬の感度（λ）」で求めます。[1][5] 干渉を避けるために試料を希釈する場合も MVD を超えてはいけません。超えて希釈すると、限度値を超える試料でも適合と判定されるおそれがあるためです。[1][5]

反応干渉因子試験（阻害・促進）

まず、試料成分が試薬の反応を阻害または促進しないことを確認する必要があります。光学的測定法では、試料に添加したエンドトキシンの測定値が添加量の 50～200% の範囲に入らなければなりません。[1][5] 試薬の供給元、製造方法、製剤が変わった場合はこの確認をやり直します。[1][18] 試薬や試験機関を変更する際には、事前に承認した計画書に従い、同一ロットの試料で両方法を比較試験する方法が用いられます。[18][14]

タンパク質医薬品で注意すること：低回収（LER）

キレート剤（例：クエン酸）と界面活性剤（例：ポリソルベート）を併せて含むバイオ医薬品の製剤では、添加したエンドトキシンが保存時間の経過とともに検出されにくくなる「低回収（low endotoxin recovery、LER）」が報告されています。[15][16][17] PDA テクニカルレポート No. 82（2019）は、LER の機序とともに保存時間試験（hold-time study）の設計指針を扱っています。[15][17] そのため、このような製剤では反応干渉因子試験に適合していても、実際の保存条件と時間でエンドトキシンが回収されるかを別途確認する必要があります。[15][16]

新しい試薬と変わった規定

• 欧州薬局方：組換え C 因子（rFC）を用いる試験の章 2.6.32 が Supplement 10.3 で公開され、2021 年 1 月 1 日から適用されています。試験する物質・製品への適合性を示した後、LAL 法と同様に使用できます。[9][10]
• 米国薬局方：組換え試薬（rFC、組換えカスケード試薬）を用いる章 <86> が 2024 年 7 月に承認され、2025 年 5 月に公式となりました。<85> に代わるものではなく追加の選択肢であり、LAL を使ってきた施設はそのまま使用できます。[6][7][8]
• 欧州薬局方は各条からウサギ発熱性物質試験を削除し、新たな一般章 5.1.13（発熱性）を設けました。2025 年 7 月 1 日から適用され、製造者はリスク評価に基づき単球活性化試験などの in vitro 試験を選びます。[11][12]
• 米国 FDA は 2026 年 3 月に「Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers」第 2 版（最終版）を公表しました。2012 年の初版を改訂したものなので、米国向けの申請資料は第 2 版に基づいて確認し直します。[13][14]

試験計画チェックリスト

出典