Qué revisar al planificar la prueba de endotoxinas bacterianas

Qué detecta la prueba de endotoxinas

La prueba de endotoxinas bacterianas (Bacterial Endotoxins Test, BET) detecta o cuantifica las endotoxinas de bacterias gramnegativas.[1][9] Tradicionalmente utiliza como reactivo un lisado de amebocitos de cangrejo herradura (LAL, limulus amoebocyte lysate).[1][9]

Tres técnicas y cómo se decide el resultado

• Gel-clot: el resultado se lee según si el reactivo forma un gel.[1][2]
• Turbidimétrico y cromogénico: métodos fotométricos, cada uno dividido en técnicas de punto final (end-point) y cinéticas (kinetic).[1][2]

Según ICH Q4B Annex 14, las pruebas de endotoxinas de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP <85>), la Farmacopea Europea (Ph. Eur. 2.6.14) y la Farmacopea Japonesa (JP 4.01) pueden usarse de forma intercambiable en las regiones ICH, siempre que se cumplan sus condiciones.[2][3] Puede usarse cualquiera de las tres técnicas, pero en caso de duda o controversia la decisión final se toma con el método gel-clot.[1][3]

Límite de endotoxinas y dilución máxima válida (MVD)

Para productos parenterales, el límite de endotoxinas se calcula a partir de la dosis como K/M. M es la dosis máxima por kilogramo de peso corporal, y K es 5 EU/kg para vías distintas de la intratecal y 0,2 EU/kg para la administración intratecal.[1][4]

La dilución máxima válida (MVD) es la mayor dilución a la que aún puede determinarse el límite de endotoxinas, y se calcula como "límite de endotoxinas × concentración de la muestra ÷ sensibilidad del reactivo (λ)".[1][5] Al diluir una muestra para superar una interferencia no debe superarse la MVD, porque más allá de ella una muestra por encima del límite podría aprobar.[1][5]

Prueba de factores de interferencia (inhibición y potenciación)

Primero hay que confirmar que los componentes de la muestra no inhiben ni potencian la reacción del reactivo. En los métodos fotométricos, el valor medido de la endotoxina añadida a la muestra debe estar entre el 50 % y el 200 % de la cantidad añadida.[1][5] Esta comprobación se repite cuando cambian la fuente del reactivo, el método de fabricación o la formulación.[1][18] Al cambiar de reactivo o de laboratorio de ensayo, es habitual realizar pruebas comparativas de ambos métodos con muestras del mismo lote según un protocolo aprobado de antemano.[18][14]

Precaución en productos proteicos: baja recuperación de endotoxinas (LER)

En formulaciones biológicas que contienen a la vez un agente quelante (p. ej., citrato) y un tensioactivo (p. ej., polisorbato) se ha descrito la "baja recuperación de endotoxinas (low endotoxin recovery, LER)", en la que la endotoxina añadida se detecta cada vez peor a medida que pasa el tiempo de almacenamiento.[15][16][17] El Informe Técnico PDA n.º 82 (2019) trata los mecanismos de la LER y orientaciones para diseñar estudios de tiempo de espera (hold-time).[15][17] Por ello, en estas formulaciones conviene comprobar por separado si la endotoxina se recupera en las condiciones y tiempos reales de almacenamiento, aunque se haya superado la prueba de factores de interferencia.[15][16]

Nuevos reactivos y requisitos modificados

• Farmacopea Europea: el capítulo 2.6.32, una prueba con factor C recombinante (rFC), se publicó en el Suplemento 10.3 y se aplica desde el 1 de enero de 2021. El método puede usarse como los métodos basados en LAL una vez demostrada su idoneidad para la sustancia o el producto que se va a analizar.[9][10]
• Farmacopea de los Estados Unidos: el capítulo <86>, que utiliza reactivos recombinantes (rFC y reactivos de cascada recombinante), se aprobó en julio de 2024 y entró en vigor oficialmente en mayo de 2025. No sustituye al <85>, sino que añade una opción, y quienes usan LAL pueden seguir haciéndolo.[6][7][8]
• La Farmacopea Europea retiró la prueba de pirógenos en conejo de sus monografías y añadió un nuevo capítulo general, 5.1.13 (Pirogenicidad). Se aplica desde el 1 de julio de 2025, y los fabricantes eligen una prueba in vitro, como la prueba de activación de monocitos, a partir de una evaluación de riesgos.[11][12]
• La FDA de EE. UU. publicó en marzo de 2026 la Edición 2 (final) de "Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers". Como revisa la primera edición de 2012, la documentación para presentaciones en EE. UU. debe revisarse de nuevo según la Edición 2.[13][14]

Lista de verificación para planificar la prueba

Fuentes