Condiciones de proceso que hay que definir al concentrar e intercambiar tampón por TFF

Qué hacen la concentración y el intercambio de tampón por TFF

En la TFF, la ultrafiltración (UF) saca el disolvente y las moléculas pequeñas a través de la membrana para concentrar el producto, y la diafiltración (DF) añade tampón nuevo en la misma cantidad que sale para cambiar el tampón.[9][10] En los procesos biofarmacéuticos, esta etapa suele seguir a la purificación y ajusta la concentración y el tampón de la formulación final.[12][14]

Elección de la membrana: corte de peso molecular y formato

• La regla general es elegir un corte de peso molecular (MWCO) de 3 a 6 veces menor que el peso molecular de la molécula que se quiere retener.[5][6][7] Si solo se concentra, el extremo de 3 veces suele bastar; si se hace mucho intercambio de tampón, una membrana más cerrada, hacia el extremo de 6 veces, es más segura.[5][7]
• El peso molecular es solo una referencia aproximada. El paso depende de la forma, la carga y las condiciones del tampón, por lo que conviene confirmar la retención con el producto real.[5][8]
• Las membranas existen en casetes de lámina plana y en fibra hueca (hollow fiber). En lugar de suponer que la fibra hueca siempre es más suave, hay quien recomienda decidir probando la calidad del producto en las condiciones reales de caudal y canal.[21][22]

Presión de operación (TMP) y caudal de recirculación

Al subir la TMP, el flujo de permeado aumenta al principio, pero a partir de cierto punto apenas crece.[1][3] Si en esa zona solo se sigue subiendo la presión, aumenta la concentración de proteína en la superficie de la membrana y con ella el riesgo de ensuciamiento (fouling) y de pérdida de rendimiento.[1][2] Por eso el punto de operación se fija con una prueba que mide el flujo variando la TMP para cada caudal de recirculación (TMP excursion).[1][2] Como la viscosidad sube al avanzar la concentración y cambia el flujo y la presión, hay que volver a comprobarlo a la concentración final y en el nuevo tampón.[2][4]

Número de diavolúmenes y concentración de diafiltración

Un diavolumen (DV) es el volumen de tampón nuevo añadido dividido por el volumen de producto en ese momento. En la diafiltración a volumen constante, una sustancia que atraviesa libremente la membrana disminuye en teoría según C/C0 = e^(-N), de modo que tras 5 DV queda aproximadamente un 0,7 %.[9] En la práctica, la mezcla insuficiente, la retención parcial por la membrana y la unión a la proteína hacen que se elimine menos, así que se mide lo que queda y se fija el número de diavolúmenes a partir de ello.[9][10]

También hay que decidir a qué concentración hacer el intercambio. Diluido, el flujo es alto pero el volumen es grande; concentrado, se necesita menos tampón pero el flujo es bajo, así que existe una concentración óptima intermedia.[1][11]

Diferencias de pH y excipientes a alta concentración, y volumen final

• Al concentrar a niveles altos, los componentes cargados del tampón (por ejemplo, la histidina) pueden ser desplazados del lado de la proteína (efecto Donnan), y el pH y la concentración de excipientes del producto final pueden diferir del tampón añadido.[12][13][14] Por eso a veces se ajusta de antemano la concentración o el pH del tampón de diafiltración.[12][14]
• El volumen retenido en el equipo (hold-up) influye en cuánto se recupera, y el volumen mínimo de trabajo (MWV) limita cuánto se puede concentrar.[15][16][17] Desplazar el producto con tampón al final aumenta la recuperación pero lo diluye, así que hay que decidir cuánto concentrar por encima del objetivo para compensarlo.[15][16]
• La TFF de paso único (SPTFF), que concentra en una sola pasada sin recirculación, se estudia y se usa para conectar procesos continuos y reducir el volumen retenido en el equipo.[23][24]

Comprobaciones de limpieza y reutilización

• Para comprobar si la membrana quedó limpia, se compara la permeabilidad al agua normalizada (NWP, flujo de agua ÷ TMP) con su valor inicial.[18][20]
• La limpieza con hidróxido de sodio (NaOH) es habitual, pero la concentración, la temperatura y el tiempo deben seguir los datos del fabricante de la membrana.[19][25]
• Después de instalar el casete y lavarlo con agua, se realiza una prueba de integridad antes de usarlo.[19][20]

Lista de verificación de condiciones de proceso

Fuentes