Criterios de ensayo de ADN residual de la célula huésped y HCP: origen de las cifras y puntos de comprobación de los métodos de ensayo

Por qué se realizan los ensayos

En los productos biofarmacéuticos producidos en células pueden quedar ADN y proteínas procedentes de las células de producción. ICH Q6B clasifica las proteínas de la célula huésped (HCP, host cell protein) y el ADN de la célula huésped como impurezas relacionadas con el proceso (process-related impurity) derivadas del sustrato celular [1][9]. El ADN residual se controla por su potencial tumorigénico y su infectividad [2][3], y las HCP porque pueden afectar a la calidad, la eficacia y la seguridad del producto [8][9].

ADN residual: origen de las cifras

Fuentes: [2][3][4][5]

• Todas las cifras anteriores son recomendaciones (recommendation) y no una norma única aplicable a todos los productos. La WHO dispone que el límite aceptable para cada producto se establezca en consulta con la autoridad reguladora, teniendo en cuenta las características del sustrato celular, el uso previsto y el efecto del proceso sobre el tamaño, la cantidad y la actividad del ADN [2].
• «Aproximadamente 200 bp» es el valor que las guías de la FDA presentan como tamaño de un gen funcional [3][4].
• Si se utilizan células tumorigénicas (p. ej., HEK293), pueden ser necesarios límites más estrictos [3][4].
• La WHO indica que algunas vacunas de virus vivos difíciles de purificar pueden superar los 10 ng/dose, y que esto constituye una excepción que debe tratarse con la autoridad reguladora [2].

HCP: no existe un límite numérico uniforme

Las directrices relativas a HCP no presentan un límite numérico, y el nivel aceptable se establece para cada producto en función de las condiciones clínicas, como la dosis y la vía de administración [9][10]. Las preguntas y respuestas de la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) orientan a incluir normalmente el ensayo de HCP en la especificación del principio activo y a fijar el límite superior en un valor cuya justificación clínica se haya confirmado [8]. Los detalles de los métodos de ensayo de HCP se tratan en la Farmacopea Europea 2.6.34 y en USP <1132> [8][9][10].

Métodos de ensayo

• ADN residual: la PCR cuantitativa (qPCR) es el método más utilizado [7][11]. USP <509> proporciona un método de medición por qPCR y el procedimiento de extracción que lo precede para medicamentos recombinantes derivados de CHO y de E. coli [6][7].
• HCP: el enzimoinmunoensayo (ELISA), que mide muchas HCP a la vez, es el método de ensayo estándar [9][12]. Como los anticuerpos del ELISA no reconocen todas las HCP, se utiliza junto con él la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), que permite identificar y cuantificar HCP individuales, como método ortogonal (orthogonal, complementario y basado en un principio distinto) [9][12].

Qué verificar al elegir un método de ensayo o un kit

• Especificidad por el huésped: se verifica que el ensayo corresponda a la célula de producción (CHO, E. coli, HEK293, Vero, etc.) y que no reaccione con ADN de otras especies [6][11].
• Sensibilidad y límite de cuantificación (LOQ): se verifica que sean suficientemente inferiores al límite objetivo referido a una dosis. El documento de la FDA de 1997 propuso una sensibilidad del orden de 10 pg [5].
• Recuperación de la extracción: como el ADN se mide después de extraerlo de muestras con alto contenido de proteínas, la eficiencia de la extracción se verifica mediante la recuperación de adición (spike) [7][11].
• Cobertura de los anticuerpos (coverage): debe evaluarse con qué amplitud los anticuerpos del ELISA reconocen las HCP del proceso en cuestión [8][9][10].
• Ensayos genéricos y específicos del proceso: los kits comerciales genéricos (generic) se utilizan ampliamente en las fases iniciales del desarrollo. Si la cobertura es insuficiente, se desarrolla un ELISA de plataforma o específico del proceso (process-specific), y las autoridades reguladoras normalmente lo esperan antes de la entrada en la fase 3 clínica [9][10].

Fuentes