规划细菌内毒素检查时需确认的事项

内毒素检查检测什么

细菌内毒素检查（Bacterial Endotoxins Test，BET）用于检测或定量来自革兰氏阴性菌的内毒素。[1][9] 传统上使用鲎血细胞提取物（LAL，limulus amoebocyte lysate）作为试剂。[1][9]

三种检测方法与判定标准

• 凝胶法（gel-clot）：根据试剂是否形成凝胶进行判定。[1][2]
• 比浊法（turbidimetric）与显色法（chromogenic）：属于光度测定法，各自分为终点法（end-point）和动态法（kinetic）。[1][2]

根据 ICH Q4B Annex 14，在满足其条件的前提下，美国药典（USP <85>）、欧洲药典（Ph. Eur. 2.6.14）和日本药典（JP 4.01）的内毒素检查可在 ICH 地区互换使用。[2][3] 三种方法均可使用，但如结果有疑问或争议，以凝胶法作最终判定。[1][3]

内毒素限度与最大有效稀释倍数（MVD）

注射剂的内毒素限度按剂量以 K/M 计算。M 为每千克体重的最大剂量；K 在非鞘内给药时为 5 EU/kg，鞘内给药时为 0.2 EU/kg。[1][4]

最大有效稀释倍数（MVD）是仍能判定内毒素限度的最大稀释倍数，按"内毒素限度 × 样品浓度 ÷ 试剂灵敏度（λ）"计算。[1][5] 为消除干扰而稀释样品时也不得超过 MVD，因为超过后，超出限度的样品也可能被判为合格。[1][5]

干扰试验（抑制与增强）

首先须确认样品成分不会抑制或增强试剂反应。光度法中，加入样品的内毒素测定值须在加入量的 50~200% 范围内。[1][5] 试剂来源、生产方法或制剂发生变化时，须重新进行该确认。[1][18] 更换试剂或检测机构时，常用的做法是按事先批准的方案，用同一批次样品对两种方法进行比对试验。[18][14]

蛋白类药物需注意：低内毒素回收（LER）

在同时含有螯合剂（如柠檬酸盐）和表面活性剂（如聚山梨酯）的生物药制剂中，已有"低内毒素回收（low endotoxin recovery，LER）"的报道，即加入的内毒素随着放置时间的延长而越来越难以检出。[15][16][17] PDA 技术报告 No. 82（2019）论述了 LER 的机理以及放置时间研究（hold-time study）的设计指南。[15][17] 因此，对于此类制剂，即使通过了干扰试验，也有必要另行确认在实际储存条件和时间下能否回收内毒素。[15][16]

新试剂与规定变化

• 欧洲药典：使用重组 C 因子（rFC）的检查章节 2.6.32 收载于 Supplement 10.3，自 2021 年 1 月 1 日起适用。在证明其适用于待检物质或产品后，可像 LAL 方法一样使用。[9][10]
• 美国药典：使用重组试剂（rFC、重组级联试剂）的 <86> 章于 2024 年 7 月获批，2025 年 5 月正式生效。它不是取代 <85>，而是新增的选择，原来使用 LAL 的单位可以继续使用。[6][7][8]
• 欧洲药典已从各论中删除家兔热原检查，并新增通则 5.1.13（热原性）。自 2025 年 7 月 1 日起适用，由生产企业根据风险评估选择单核细胞活化试验等体外试验。[11][12]
• 美国 FDA 于 2026 年 3 月发布了《Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers》第 2 版（最终版）。由于它修订了 2012 年的第 1 版，向美国递交的资料应按第 2 版重新确认。[13][14]

检测计划核对表

参考来源